Piwil2重編程兒童成纖維細胞形成腫瘤干細胞的初步研究.pdf

1、目的: 觀察精原干細胞自我更新基因Piwil2重編程兒童成纖維細胞的細胞形態(tài)及功能特征變化，建立Piwil2調(diào)控腫瘤干細胞發(fā)生過程的細胞實驗?zāi)Ｐ汀?br>　　方法: 將攜帶Piwil2-GFP標(biāo)記的和空載的目的基因GFP標(biāo)記的慢病毒載體分別感染原代培養(yǎng)的小兒包皮成纖維細胞，篩選建立穩(wěn)定表達Piwil2-GFP和GFP成纖維細胞系，觀察細胞形態(tài)變化及腫瘤球形成過程。體外分析細胞染色體核型，RT-PCR鑒定重編程后細胞的干細胞標(biāo)記物OCT-

2、4，Sox2，Nanog，c-Myc，Klf-4及三胚層分化的相關(guān)標(biāo)志物Nestin，Tubb3，Brabury, CATA-4等。裸鼠體內(nèi)成瘤實驗，組織學(xué)觀察腫瘤形態(tài)，RT-PCR，免疫組織化學(xué)進一步分析分析干細胞及各胚層指標(biāo)在裸鼠腫瘤中的表達。
　　結(jié)果:
　　①熒光顯微鏡觀察到轉(zhuǎn)染Piwil2-GFP和空載GFP成纖維細胞轉(zhuǎn)染后，兩組細胞均穩(wěn)定表達綠色熒光。48h流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率為51.2％和45.7％，繼續(xù)篩選

3、培養(yǎng)后穩(wěn)定表達率約70％，且Piwil2-GFPFB細胞體積變小，形態(tài)逐漸由長梭型變?yōu)閳A形并出現(xiàn)集落樣生長，集落可形成圓形克隆。
　?、赗T-PCR檢測Piwil2-GFP FB細胞過表達Piwil2，表達干細胞多能基因Oct-4，Sox2，Nanog，Klf-4，c-Myc及三胚層分化相關(guān)基因。
　?、廴旧w核型結(jié)果顯示Piwil2-GFP FB細胞染色體分別為67-70條的超二倍體結(jié)構(gòu)，可見多倍體染色體。
　　④“

4、腫瘤球”樣克隆裸鼠體內(nèi)移植2周時100％形成腫瘤，腫瘤組織學(xué)及免疫組化鑒定為來表達多種外胚層，中胚層及內(nèi)胚層腫瘤標(biāo)志物的惡性腫瘤，RT-PCR顯示細胞及裸鼠腫瘤表達干細胞多能基因Oct-4，Nanog，Sox2以及三胚層特征標(biāo)記物。
　　結(jié)論:
　?、貾iwil2基因成功轉(zhuǎn)染兒童成纖維細胞且細胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，形成腫瘤球樣集落。
　?、赑iwil2重編程后的成纖維細胞具有干細胞和多潛能分化特征，致瘤性及腫瘤細胞異質(zhì)性。