脂肪干細(xì)胞修復(fù)成纖維細(xì)胞放射性損傷的機(jī)制研究.pdf

1、核泄漏事件、日常放療造成的醫(yī)源性放射損傷和制造業(yè)的輻射消毒等使人類暴露在放射性射線的危險(xiǎn)性大大提高。放射性皮膚損傷是放射治療中最常見(jiàn)的并發(fā)癥，是指放療過(guò)程中各種放射性元素對(duì)放療區(qū)域皮膚組織造成的肉眼可見(jiàn)的病損，常見(jiàn)的放射性元素包括X線、γ射線、質(zhì)子、粒子以及電子等各類電離輻射。放射性皮膚損傷的發(fā)生率很高，若不采取保護(hù)措施，約90％的放療患者會(huì)出現(xiàn)局部皮膚紅斑，嚴(yán)重者會(huì)發(fā)生皮膚脫落和潰瘍，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。真皮和結(jié)締組織中主要細(xì)胞組成

2、為成纖維細(xì)胞(Fibroblasts，F(xiàn)b)，它在創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程發(fā)揮主導(dǎo)作用。
　　脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是脂肪來(lái)源的具有多種分化潛能的干細(xì)胞。它取材方便、能向多種細(xì)胞分化并且能分泌多種細(xì)胞因子來(lái)修復(fù)損傷。ADSCs與放射損傷的修復(fù)關(guān)系密切，可能通過(guò)自分泌和誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞旁分泌多種細(xì)胞因子修復(fù)放射損傷。何種細(xì)胞因子通過(guò)何種途徑參與這種修復(fù)過(guò)程尚未明確。
　　磷脂酰肌醇3激酶

3、-蛋白激酶B(phosphatidylinositol3-kinase-protein kinase B，PI3K-PKB，也稱PI3K-Akt)和絲裂原活化蛋白激酶(rnitogen-activated protein kinase，MAPK)通路在放射損傷中的調(diào)控作用在多項(xiàng)研究中得到證實(shí)，近年來(lái)已明確部分長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，LncRNA)在放射領(lǐng)域扮演重要角色，部分LncRNA與PI3K-Akt通

4、路發(fā)生相互作用也受到關(guān)注。ADSCs在放射損傷修復(fù)中通過(guò)何種信號(hào)通路發(fā)揮作用，LncRNA是否參與其修復(fù)機(jī)制目前尚未明確。
　　基于以上考慮，本課題擬通過(guò)高通量測(cè)序和基因沉默技術(shù)對(duì)ADSCs修復(fù)放射性損傷機(jī)制進(jìn)行研究。
　　第一部分 ADSCs和Fb原代培養(yǎng)、共培養(yǎng)模型的建立以及ADSCs對(duì)Fb放射損傷后的影響
　　目的:原代提取ADSCs和Fb，建立共培養(yǎng)模型研究ADSCs的干預(yù)對(duì)放射損傷成纖維細(xì)胞增殖、凋亡以及細(xì)胞

5、周期的影響。
　　方法:用酶消化法從大鼠腹股溝脂肪和真皮組織中原代提取ADSCs和Fb，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)、多向誘導(dǎo)分化以及免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行鑒定。用0.4μmTranswell共培養(yǎng)板建立非接觸式共培養(yǎng)模型，建模成功后實(shí)驗(yàn)分為4組，F(xiàn)b1組為成纖維細(xì)胞對(duì)照組，F(xiàn)b2組為8GyX射線照射的成纖維細(xì)胞組，F(xiàn)b3組為ADSCs干預(yù)的8GyX射線照射的成纖維細(xì)胞組，陰性對(duì)照組為NRK細(xì)胞干預(yù)的8GyX射線照射的成纖維細(xì)胞組。CCK-8法檢測(cè)

6、細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡和周期變化。
　　結(jié)果:酶消化法能提取較高純度原代細(xì)胞，經(jīng)鑒定提取的ADSCs可向成骨、成脂肪誘導(dǎo)分化，ADSCs表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD31和CD45陽(yáng)性率達(dá)標(biāo)，成纖維細(xì)胞高表達(dá)波形蛋白Vimentin。Fb2組經(jīng)8Gy放射損傷的成纖維細(xì)胞較Fb1對(duì)照組增殖能力顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，F(xiàn)b3組ADSCs共培養(yǎng)干預(yù)后的成纖維細(xì)胞增殖能力較Fb2組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

7、P＜0.05)。Fb2組較Fb1對(duì)照組凋亡顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，F(xiàn)b3組ADSCs共培養(yǎng)干預(yù)后的成纖維細(xì)胞凋亡較Fb2組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。8Gy照射后Fb2組成纖維細(xì)胞周期阻滯在G2期，ADSCs干預(yù)后Fb3組細(xì)胞周期較Fb2組由G2/M向G1/S進(jìn)展，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:成纖維細(xì)胞在接受了8GyX射線放照射后細(xì)胞增殖活力減弱、凋亡增加、周期阻滯在G2期。當(dāng)

8、我們進(jìn)行了ADSCs的共培養(yǎng)干預(yù)后成纖維細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)、凋亡減少、細(xì)胞周期進(jìn)程加快。
　　第二部分 ADSCs對(duì)大鼠放射性皮膚損傷的影響
　　目的:研究ADSCs在大鼠放射性皮膚損傷模型體內(nèi)的存活情況以及對(duì)大鼠放射性皮膚損傷導(dǎo)致的凋亡的影響。
　　方法:改良Rifkin LH皮膚放射模型，實(shí)驗(yàn)分為5組，空白對(duì)照組、單純照射組、ADSCs靜脈注射組、ADSCs局部注射組和PBS局部注射組。照射采用背部2cm×2cm區(qū)域

9、接受20Gy照射，ADSCs注射量為2×106，Luciferase和GFP雙標(biāo)慢病毒轉(zhuǎn)染標(biāo)記。不同時(shí)間點(diǎn)用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)觀察ADSCs在體內(nèi)存活情況，取材進(jìn)行冰凍切片在熒光顯微鏡下觀察，制作石蠟切片行Tunnel凋亡染色。
　　結(jié)果:ADSCs靜脈注射組出現(xiàn)肺攔截，24h左右活體成像顯示熒光消失，ADSCs局部注射組至少在注射后15天內(nèi)仍然能夠檢測(cè)到熒光。單純照射組較空白對(duì)照組凋亡顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

10、ADSCs局部注射組較單純照射組凋亡顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。ADSCs靜脈注射組較單純照射組凋亡降低(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:2×106 ADSCs局部注射在經(jīng)20Gy照射的大鼠背部皮膚可以至少存活15天，ADSCs可以使放射性皮膚損傷引起的凋亡降低。
　　第三部分 ADSCs對(duì)Fb放射性損傷干預(yù)的高通量mRNA/LncRNA測(cè)序、蛋白質(zhì)譜檢測(cè)以及驗(yàn)證
　　目的:ADSCs共培

11、養(yǎng)干預(yù)放射損傷的成纖維細(xì)胞，篩查基因和蛋白水平的差異表達(dá)，預(yù)測(cè)可能發(fā)揮作用的信號(hào)通路并進(jìn)行驗(yàn)證。
　　方法:實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照Fb組、8Gy照射后的Fb2組以及經(jīng)ADSCs共培養(yǎng)干預(yù)后的Fb3組。采用高通量mRNA/LncRNA測(cè)序和蛋白質(zhì)譜檢測(cè)篩選出差異基因和蛋白，測(cè)序和蛋白質(zhì)譜聯(lián)合分析可能作用的信號(hào)通路，篩查L(zhǎng)ncRNA并預(yù)測(cè)靶基因。
　　結(jié)果:8Gy照射后的Fb2組較空白對(duì)照組P53通路發(fā)生明顯上調(diào)。經(jīng)ADSCs共培養(yǎng)干

12、預(yù)后的Fb3組較單純8Gy照射的Fb2組PI3K-Akt和MAPK通路顯著上調(diào)。Real time-PCR和Western-blot驗(yàn)證與以上通路相關(guān)的凋亡和周期分子，F(xiàn)b2 vs Fb1上調(diào)的有P53、P21、P27、CyclinB、Bax以及Cleaved Caspase-3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);下調(diào)的有Cyclin D1、Bcl-2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Fb3 vsFb2上調(diào)的有Cyclin D1、Bc

13、l-2和c-myc，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);下調(diào)的有CyclinB、Bax、Cleaved Caspase-3、P21和P27，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。從篩查出的40條LncRNA結(jié)合Real time-PCR驗(yàn)證，鎖定變化最顯著的4條，分別是LNC_000473、ENSRNOT00000076586、LNC_001034和LNC_001030。
　　結(jié)論:8GyX線照射后的成纖維細(xì)胞可能通過(guò)P53通路上調(diào)介導(dǎo)

14、放射損傷，ADSCs可能通過(guò)PI3K-Akt和MAPK通路激活使成纖維細(xì)胞發(fā)生修復(fù)。LNC_000473、ENSRNOT00000076586、LNC_001034和LNC_001030可能在ADSCs修復(fù)成纖維細(xì)胞放射損傷中扮演重要角色。
　　第四部分 ADSCs修復(fù)成纖維細(xì)胞放射性損傷的機(jī)制研究
　　目的:檢測(cè)共培養(yǎng)上清液中差異表達(dá)的細(xì)胞因子，用篩查出的細(xì)胞因子干預(yù)放射損傷成纖維細(xì)胞后研究其增殖、凋亡和細(xì)胞周期的變化以及

15、在信號(hào)通路中的作用。初步探討LncRNA_473在ADSCs修復(fù)成纖維細(xì)胞放射損傷中的作用。
　　方法:細(xì)胞因子蛋白芯片篩查共培養(yǎng)上清中的差異表達(dá)并進(jìn)行Elisa驗(yàn)證。用篩查出的細(xì)胞因子刺激放射損傷的成纖維細(xì)胞，檢測(cè)其增殖、凋亡及周期的變化，Western-blot檢測(cè)相關(guān)通路的激活情況。成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA沉默LncRNA_473，檢測(cè)ADSCs共培養(yǎng)干預(yù)下成纖維細(xì)胞增殖和凋亡情況。
　　結(jié)果:細(xì)胞因子GM-CSF組和

16、VEGF組較對(duì)照組p-Akt和p-Erk表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，這說(shuō)明GM-CSF組和VEGF可能通過(guò)激活PI3K-Akt和MAPK通路發(fā)揮放射損傷修復(fù)作用。ADSCs共培養(yǎng)同時(shí)沉默LncRNA_473，成纖維細(xì)胞增殖能力較單純ADSCs共培養(yǎng)組成纖維細(xì)胞增殖能力下降、凋亡增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:GM-CSF、VEGF和LncRNA_473可能在ADSCs修復(fù)成纖維細(xì)胞放射損傷中發(fā)揮