ut對(duì)pq中毒后損傷肺成纖維細(xì)胞的修復(fù)作用探究

1、姓名：謝永鵬,烏司他丁對(duì)百草枯中毒后損傷肺成纖維細(xì) 胞的修復(fù)作用研究,內(nèi)容介紹,立項(xiàng)依據(jù)與創(chuàng)新,實(shí)驗(yàn)技術(shù)及過(guò)程,研究背景-百草枯簡(jiǎn)介,百草枯(paraquat,PQ)，20%，250mL裝；是一種有機(jī)雜環(huán)類(lèi)廣譜非選擇性接觸性除草劑及脫葉劑。PQ對(duì)人畜具有較強(qiáng)毒性，人口服致死量約為1～3g。中毒后致急性肺損傷及肺纖維化改變?yōu)槠涮禺惐憩F(xiàn)缺少特效解毒劑和能夠在血液或組織中與PQ結(jié)合的螯合劑，PQ

2、中毒的病死率高達(dá)60%～80%。,研究背景-烏司他丁簡(jiǎn)介,烏司他丁 (Ulinastain ,UT)，本品是從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來(lái)的一種糖蛋白，由143個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約6700。本品屬蛋白酶抑制劑，對(duì)胰蛋白酶、α-糜蛋白酶等絲氨酸蛋白酶及粒細(xì)胞彈性蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、巰基酶、纖溶酶等多種酶有抑制作用。另具有穩(wěn)定溶酶體膜，抑制溶酶體酶的釋放，抑制心肌抑制因子（MDF）產(chǎn)生，清除氧自由基及抑制炎癥介質(zhì)釋放的作用。,

3、,研究背景-肺成纖維細(xì)胞,正常情況下，MRC-5存在精確調(diào)控，分泌的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）處于動(dòng)態(tài)平衡。膠原蛋白是主要的ECM蛋白，占肺干重1/5（Ⅰ、Ⅲ）。肺損傷后，MRC-5及膠原蛋白過(guò)度合成，參與病理修復(fù)。膠原蛋白的生成和沉積將導(dǎo)致肺纖維化,肺成纖維細(xì)胞,研究背景-結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）,CTGF屬于TGF-β家族，作為T(mén)GF-β的下游因子，主要促進(jìn)細(xì)胞增殖、粘附，ECM異常沉淀早期即刻蛋白，主要表達(dá)于活化的肺

4、纖維細(xì)胞，見(jiàn)于肺纖維變性早期，晚期極弱?？勺鳛槔w維化病變?cè)缙谠\斷標(biāo)志物。促纖維化作用呈劑量依賴(lài)，可被抗CTGF抗體拮抗。,研究背景-細(xì)胞力學(xué)特性,力學(xué)特性（粘彈性）是細(xì)胞的一種本質(zhì)屬性，細(xì)胞所處的生理/病理狀態(tài)、組織環(huán)境和力環(huán)境不同，所表現(xiàn)的力學(xué)特性也不盡相同。解釋一些組織器官的生理、病理變化以及解釋疾病的發(fā)病與治療機(jī)理等具有重要的意義。 目前為止，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有關(guān)百草枯中毒過(guò)程中肺成纖維細(xì)胞生物力學(xué)特性變化的報(bào)道。

5、,前期工作,課題組在這方面已有一定的工作基礎(chǔ)。部分工作人員，曾在吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20100138）百草枯致中毒性肺纖維化發(fā)病機(jī)理的力學(xué)生物學(xué)研究的支持下，研究了百草枯致中毒后短時(shí)間內(nèi)肺成纖維細(xì)胞的 CTGF 的表達(dá)、細(xì)胞增殖情況及細(xì)胞粘彈性的變化等，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明百草枯影響了細(xì)胞的生物學(xué)特性和生物力學(xué)特性。并已發(fā)表文章2篇。 1. Guohui Wang，Yongpeng Xie，Dan Shi，Nan Zhang. T

6、he Effects ofmechanical stimulation on proliferation and CTGF expression of human lung fibroblast. The 4th International Conference on Image and Signal Processing, (2011年10月發(fā)表，EI收錄) 2. Guohui Wang，Yongpeng Xie，Nan Z

7、hang. The Study of CTGF Expression of Lung Fibroblasts After Treated by Paraquat，第十六屆亞太呼吸年會(huì).( 2011年11月發(fā)表，SCI收錄),人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5,Olympus倒置相差顯微鏡:培養(yǎng)皿中細(xì)胞正常生長(zhǎng)，形態(tài)呈長(zhǎng)梭形。,百草枯處理前后MRC-5細(xì)胞顯微圖片,A：正常MRC-5細(xì)胞,B：50mg/LPQ培養(yǎng)液處理后,C：100mg/LPQ培

8、養(yǎng)液處理后,D：200mg/LPQ培養(yǎng)液處理后,PQ對(duì)MRC-5 CTGF表達(dá)的影響,各組細(xì)胞CTGF濃度比較（*P<0.05）,PQ對(duì)MRC-5生物力學(xué)特性影響,肺成纖維細(xì)胞在30mm水柱負(fù)壓下吸入長(zhǎng)度隨時(shí)間變化情況,PQ對(duì)MRC-5生物力學(xué)特性影響,經(jīng)過(guò)PQ處理后MRC-5細(xì)胞的粘彈性各項(xiàng)參數(shù)均明顯小于正常MRC-5細(xì)胞 也就是說(shuō)經(jīng)過(guò)PQ處理后的MRC-5生物力學(xué)特性降低，變得較“軟” 在經(jīng)過(guò)100mg/L和200mg

9、/L百草枯處理后MRC-5粘彈性要小于50mg/L而100mg/L和200mg/L百草枯處理組之間細(xì)胞的粘彈性無(wú)明顯差異,各組細(xì)胞粘彈性參數(shù)比較,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究烏司他丁對(duì)百草枯中毒后損傷肺成纖維細(xì)胞的修復(fù)作用，得到烏司他汀對(duì)百草枯致肺損傷的治療效果及治療原理。,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,應(yīng)用烏司他汀注射液處理經(jīng)不同濃度百草枯損傷的肺成纖維細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞CTGF的表達(dá)及細(xì)胞的粘彈性，說(shuō)明烏司他汀對(duì)百草枯中毒后損傷肺成纖維細(xì)胞的修復(fù)

10、作用，研究烏司他汀對(duì)百草枯致肺損傷的治療效果并解釋其治療原理。,試驗(yàn)器材,儀器及材料 細(xì)胞：人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5，中科院細(xì)胞庫(kù)。試劑：胎牛血清培養(yǎng)基、胰蛋白酶、CTGF ELISA 試劑盒。主要儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱、 高低速離心機(jī)、微管吸吮系統(tǒng) 、流式細(xì)胞儀、ELx-800 NB酶標(biāo)儀及配套洗板機(jī)等。,微管吸吮系統(tǒng),本實(shí)驗(yàn)我們采用微管吸吮技術(shù)檢測(cè)肺成纖維細(xì)胞在一定負(fù)壓下吸入長(zhǎng)度隨時(shí)間的變化，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)線性固體粘彈性模

11、型得到了正常及百草枯處理后肺成纖維細(xì)胞的生物力學(xué)特性（粘彈性參數(shù)），研究百草枯對(duì)人肺成纖維細(xì)胞生物力學(xué)特性的影響。,,試驗(yàn)方法,1.用含不同濃度百草枯的細(xì)胞培養(yǎng)液（50mg/L、100mg/L、200mg/L）處理常規(guī)培養(yǎng)的肺成纖維細(xì)胞12h。12h后換含烏司他丁的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，在烏司他丁處理后0h、12h、24h、36h、48h獲取細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。2.通過(guò)PCR技術(shù)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)肺成纖維細(xì)胞CTGF的表達(dá)。3.

12、結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)線性黏彈性模型，采用微管吸吮技術(shù)測(cè)試細(xì)胞的力學(xué)特性（粘彈性參數(shù)）,,技術(shù)流程圖,,,擬解決的技術(shù)難題,擬采集數(shù)據(jù)結(jié)果,,,UT對(duì)PQ處理后MRC-5增殖的影響,UT對(duì)PQ處理后MRC-5 CTGF表達(dá)的影響,,UT對(duì)PQ處理后MRC-5生物力學(xué)特性影響,創(chuàng)新點(diǎn),a.從細(xì)胞層次來(lái)研究烏司他汀治療百草枯致肺損傷的效果及治療原理。b.根據(jù)細(xì)胞CTGF的表達(dá)及細(xì)胞粘彈性的變化來(lái)說(shuō)明細(xì)胞的損傷及修復(fù)情況。c.從力學(xué)-生物學(xué)角度來(lái)說(shuō)