RIP1在UVB引起成纖維細(xì)胞損傷中作用機(jī)制的研究.pdf

1、受體相互作用蛋白(RIP)是一種重要的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。最近,國際上3個獨(dú)立研究均發(fā)現(xiàn)RIP是細(xì)胞生存和死亡的重要交叉點(diǎn),在細(xì)胞的凋亡與存活、細(xì)胞的程序性壞死等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。其中,RIP1是RIP家族中的重要蛋白。本課題組在前期工作中通過雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)小劑量中波紫外線照射人皮膚成纖維細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)RIP1的表達(dá)明顯升高,并用RT-PRC和WesternBlot的方法證實(shí)了這一結(jié)果,但RIP1在中波紫外線照射

2、成纖維細(xì)胞中的作用研究目前尚無報(bào)道。
　　 目的:
　　 建立RIP1基因沉默的成纖維細(xì)胞模型,并確定基因沉默持續(xù)時間；通過研究RIP1與紫外線照射引起的凋亡、氧化損傷和基質(zhì)金屬蛋白酶的關(guān)系,揭示RIP1在紫外線照射成纖維細(xì)胞的作用,更全面的認(rèn)識紫外線損傷成纖維細(xì)胞的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)其中重要的蛋白,為治療和預(yù)防光線性皮膚疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.選擇合適的LWB照射劑量和觀測時間。<

3、br>　　 1)細(xì)胞懸液法進(jìn)行原代皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng),并用細(xì)胞免疫熒光及PCR的方法鑒定成纖維細(xì)胞。
　　 2)噻唑藍(lán)(MTT)比色法比較不同劑量UVB照射成纖維細(xì)胞后不同時間點(diǎn)細(xì)胞活力的變化。
　　 2.用RT-qPCR的方法選擇適合本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參基因。
　　 3.RNA干擾的方法進(jìn)行NIH3T3細(xì)胞RIP1基因轉(zhuǎn)錄后沉默,并用RT-qPCR和Western Blot進(jìn)行干擾效果及干擾持續(xù)時間的鑒定。

4、　　 4.UVB照射RIP1干擾的NIH3T3細(xì)胞,進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):
　　 1)RT-qPCR、Western Blot檢測細(xì)胞產(chǎn)生MMP mRNA和蛋白水平的變化。
　　 2)Hoechst染色法觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。
　　 3)流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率的變化.
　　 4)流式細(xì)胞術(shù)及比色法檢測細(xì)胞內(nèi)Caspase-8及-3活性的變化。
　　 5)熒光顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS活性的變

5、化。
　　 結(jié)果:
　　 (1)包皮組織胰酶消化后,用細(xì)胞懸液法成功獲得了高純度的人皮膚原代成纖維細(xì)胞。
　　 (2)劑量25-100 mJ/cm2UVB照射原代成纖維細(xì)胞24h后,細(xì)胞活性明顯下降,隨著時間的延長,細(xì)胞活性的下降更為明顯；劑量為20 mJ/cm2UVB照射原代成纖維細(xì)胞48h后,細(xì)胞活性明顯下降,確定實(shí)驗(yàn)用UVB劑量。
　　 (3)ACTB、TUBB1更適合在UVB照射成纖維細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中作

6、為基因表達(dá)研究的內(nèi)參基因,而TUBA1A及VIM不能作為此類實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參基因。
　　 (4)成功建立了RIP1干擾的NIH3T3成纖維細(xì)胞,且干擾持續(xù)時間超過96h。
　　 (5)UVB照射經(jīng)RIPl干擾的NIH3T3細(xì)胞24h后,細(xì)胞內(nèi)MMP-1、MMP-3 mRNA的表達(dá)水平明顯升高,24h后MMP-1蛋白水平的表達(dá)也明顯升高。
　　 (6)UVB照射經(jīng)RIP1干擾的NIH3T3細(xì)胞24h后,細(xì)胞出現(xiàn)凋亡形態(tài),

7、細(xì)胞凋亡率升高,且Caspase-8及-3的活性均明顯升高。
　　 (7)UVB照射經(jīng)RIP1干擾的NIH3T3細(xì)胞12h后,細(xì)胞內(nèi)活性氧的活性明顯下降。
　　 結(jié)論:
　　 1、應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)條件,選擇適合本實(shí)驗(yàn)條件的內(nèi)參基因。
　　 2、RIPl可抑制UVB照射成纖維細(xì)胞引起的MMP產(chǎn)生。
　　 3、RIP1可抑制UVB照射成纖維細(xì)胞所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。
　　 4、RIP1很可能是U