MSC與成纖維細(xì)胞的增殖及分化在創(chuàng)面愈合中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的:皮膚是人體的防御器官，皮膚的完整性對(duì)于機(jī)體抵抗病原微生物具有重要意義(1-3)。燒傷、創(chuàng)傷病人往往伴有皮膚組織的損傷，皮膚完整性的破壞導(dǎo)致皮膚屏障的功能破壞，是增加機(jī)體受病原微生物感染的重要原因之一(4-6)，促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合對(duì)于防止病情惡化、預(yù)防感染的發(fā)生及改善預(yù)后都有積極的意義(7、8)。有研究發(fā)現(xiàn)，燒傷、創(chuàng)傷等外科意外發(fā)生后，創(chuàng)傷皮膚的表面會(huì)聚集大量MSC，在創(chuàng)面微環(huán)境各種炎性因子的誘導(dǎo)下向成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞進(jìn)行分

2、化，通過(guò)一系列細(xì)胞進(jìn)程來(lái)修復(fù)創(chuàng)面(9-13)。在燒傷患者特別是大面積燒傷患者，由于大面積皮膚缺損的出現(xiàn)，后期感染甚至膿毒血癥發(fā)生的幾率大大增加，早期促進(jìn)創(chuàng)面的愈合對(duì)于預(yù)防感染的發(fā)生和改善預(yù)后十分重要(13-17)。近年來(lái)皮膚干細(xì)胞移植治療的發(fā)展為加速創(chuàng)面的愈合開(kāi)辟了一條前景光明的道路，但自身干細(xì)胞的來(lái)源有限，一定程度上又限制了皮膚干細(xì)胞移植治療的發(fā)展(16-19)。如何能夠在體外快速大量的擴(kuò)增MSC，為皮膚干細(xì)胞移植的發(fā)展提供幫助，也成

3、為了科研工作者的一個(gè)研究方向(20-22)。此外皮膚真皮纖維細(xì)胞以及表皮角質(zhì)細(xì)胞在皮膚創(chuàng)面的愈合過(guò)程中作用也不容忽視，因此本文分為兩部分分別針對(duì)如何為干細(xì)胞移植治療提供“原料”和具備“原料”后如何“加工“完成創(chuàng)面的修復(fù)進(jìn)行研究，為促進(jìn)創(chuàng)面的愈合給予理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:第一部分我們以MSC為研究對(duì)象，采用三維懸浮(RCCS)模式對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，然后通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀觀測(cè)細(xì)胞周期，觀察MSC增殖能力的變化，同時(shí)W

4、B法對(duì)其“干性”和“成骨分化”分化相關(guān)基因和細(xì)胞表面標(biāo)志進(jìn)行檢測(cè)判斷MSC分化情況，最后我們采用生化檢測(cè)和穩(wěn)定同位素氨基酸標(biāo)記技術(shù)研究細(xì)胞的代謝和蛋白質(zhì)組學(xué)的變化，并探討RCCS環(huán)境對(duì)MSC增殖與分化調(diào)控的分子機(jī)制。第二部分我們將成纖維細(xì)胞以及角質(zhì)細(xì)胞選作研究對(duì)象，采用機(jī)械拉伸模擬皮膚表面張力的變化，觀察張力變化對(duì)成纖維細(xì)胞增殖及遷移的影響及其與表皮細(xì)胞間的相互作用關(guān)系，探討其分子機(jī)制及其在皮膚創(chuàng)面愈合中發(fā)揮的作用。
　　結(jié)果:第

5、一部分研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比三維懸浮培養(yǎng)模式下CCK8和細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果均顯示MSC增殖增強(qiáng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志及WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其“干性”相關(guān)基因表達(dá)增強(qiáng)，“成骨分化”相關(guān)基因表達(dá)減弱，MSC分化受到抑制。進(jìn)一步生化檢測(cè)細(xì)胞代謝情況發(fā)現(xiàn)，三維懸浮培養(yǎng)的MSC細(xì)胞內(nèi)、外乳酸含量增加，LDH活性增加，葡萄糖消耗增加。SILAC檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞線粒體表達(dá)的基因減弱，糖酵解基因表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞能量代謝處于有氧氧化減弱，糖酵解增強(qiáng)的能量代謝失

6、衡狀態(tài)。第二部分研究發(fā)現(xiàn)與無(wú)牽拉和靜態(tài)牽拉作用力組相比，在周期性機(jī)械牽拉力下，細(xì)胞增殖曲線及細(xì)胞周期結(jié)果均顯示HF的增殖受到抑制。WB檢測(cè)HF-ECM發(fā)現(xiàn)，周期性機(jī)械牽拉力導(dǎo)致HF的ECM中Ⅰ型膠原顯著降低、而纖維連接蛋白明顯增加。將表皮細(xì)胞(HaCaT)接種于周期性牽拉力作用后的HF-ECM上，表皮細(xì)胞的增殖仍然受到抑制。將表皮細(xì)胞接種于經(jīng)過(guò)Ⅰ型膠原或纖維連接蛋白包被的基質(zhì)上，分別檢測(cè)細(xì)胞的增殖曲線、細(xì)胞周期和細(xì)胞遷移能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ⅰ

7、型膠原比纖連蛋白更能促進(jìn)細(xì)胞的增殖，而在影響細(xì)胞遷移的能力上卻不如纖連蛋白。用免疫共沉淀、哺乳動(dòng)物雙雜交和基因干擾的方法研究發(fā)現(xiàn)，周期性機(jī)械牽拉力誘導(dǎo)的抑制細(xì)胞增殖作用與intergrinβ-CASK信號(hào)通路有關(guān)。
　　結(jié)論:第一部分研究發(fā)現(xiàn)三維懸浮培養(yǎng)模式可以在體外快速大量擴(kuò)增MSC，這種MSC具有高“干性”低“分化”特性，可能與三維懸浮模式能夠誘導(dǎo)細(xì)胞處于有氧呼吸減弱，糖酵解增強(qiáng)的能量代謝狀態(tài)有關(guān)。該法是簡(jiǎn)單有效的體外擴(kuò)增MS