ITGB4BP對創(chuàng)面修復(fù)中成纖維細(xì)胞的影響及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、增生性瘢痕是皮膚真皮層受到嚴(yán)重創(chuàng)傷后的一種病理性愈合，產(chǎn)生的瘢痕及其攣縮不僅影響了患者的容貌，還能導(dǎo)致受傷部位功能障礙，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。雖然近60年來得益于治療手段的不斷提高，大多數(shù)燒傷、創(chuàng)傷患者的生命得以挽救，但由于創(chuàng)面愈合晚期形成的增生性瘢痕的發(fā)病機(jī)理尚未完全明了，因此無論是外科手術(shù)還是藥物治療對于增生性瘢痕仍無明顯療效。因此深入研究增生性瘢痕形成的機(jī)制，尋找增生性瘢痕產(chǎn)生的相關(guān)特異性基因是目前創(chuàng)傷外科研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)、重點(diǎn)

2、、難點(diǎn)問題之一。
　　 皮膚創(chuàng)傷后，創(chuàng)周出現(xiàn)缺血缺氧、炎癥反應(yīng)，創(chuàng)周微環(huán)境改變，在以TGF-β1為主的細(xì)胞因子和機(jī)械應(yīng)力的作用下，創(chuàng)周靜息成纖維細(xì)胞向具有收縮功能的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。在創(chuàng)面正常愈合中，肌成纖維細(xì)胞逐漸凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)降解，但是在增生性瘢痕愈合中肌成纖維細(xì)胞凋亡受到抑制而持續(xù)存在，活化的成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，造成膠原、蛋白多糖、糖蛋白等過度

3、沉積和膠原纖維排列紊亂，細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和降解失衡，同時肌成纖維細(xì)胞的α-平滑肌肌動蛋白能導(dǎo)致創(chuàng)面收縮引起功能障礙。
　　 目前治療增生性瘢痕主要是通過控制瘢痕中過多基因或蛋白的表達(dá)等方式，但尚未取得顯著療效。因此我們逆向思考，是否可以尋找瘢痕中表達(dá)下降的基因或蛋白，通過增加其表達(dá)，實現(xiàn)更好的控制瘢痕形成的目的。尋找的策略是瘢痕中高表達(dá)的基因或蛋白抑制了在正常情況下高表達(dá)的基因或蛋白(即與正常皮膚組織比較，瘢痕中低表達(dá)或不表達(dá)的

4、基因或蛋白)，而此被抑制的基因或蛋白正是控制正常皮膚組織不轉(zhuǎn)變?yōu)樵錾择：鄣年P(guān)鍵因素；并進(jìn)一步設(shè)想，該低表達(dá)的基因或蛋白是與瘢痕中高表達(dá)的基因產(chǎn)物有關(guān)聯(lián)的。為此，我們對增生性瘢痕和正常皮膚內(nèi)的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)P311基因高表達(dá)于新生的增生性瘢痕內(nèi)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，是促進(jìn)增生性瘢痕形成的關(guān)鍵基因之一。因此，我們以P311為切入點(diǎn)，尋找與其相互作用的、但在瘢痕組織中低表達(dá)或不表達(dá)的基因或蛋白。通過酵母雙雜交技術(shù)和

5、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET)技術(shù)篩選出P311的相互作用蛋白：整合素β4結(jié)合蛋白(Integrin beta4 binding protein，ITGB4BP)。ITGB4BP，又名真核啟動因子6(eIF6)、p27BBP，能與整合素β4(ITGB4)胞漿區(qū)發(fā)生相互作用。研究發(fā)現(xiàn)：一方面ITGB4BP作為真核起始因子參與調(diào)節(jié)核糖體40s和60s的結(jié)合形成80s

6、亞基，也能參與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)的形成而調(diào)控mRNA的降解；另一方面，ITGB4BP參與調(diào)節(jié)Wnt信號通路中的β-catenin的表達(dá)，通過影響細(xì)胞骨架和粘附發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞分化的作用。因此，一方面ITGB4BP可能通過下調(diào)促瘢痕形成相關(guān)基因和蛋白達(dá)到抑制瘢痕形成的目的；另一方面ITGB4BP也可能通過調(diào)控細(xì)胞骨架和粘附，影響細(xì)胞應(yīng)力的感知而抑制肌成纖維細(xì)胞的形成。在

7、此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，主要涉及以下三個方面：1)ITGB4BP基因和蛋白在不同來源的成纖維細(xì)胞和不同組織中的差異表達(dá)；2)通過體外試驗：在增生性瘢痕來源的成纖維細(xì)胞中強(qiáng)制高表達(dá)ITGB4BP后，觀察靶細(xì)胞在該基因作用下的功能變化及其可能的分子信號通路；3)通過在體纖維化疾病模型，觀察ITGB4BP對不同組織纖維化的影響。
　　 1、ITGB4BP低表達(dá)于增生性瘢痕來源的成纖維細(xì)胞
　　 我們首先收集了燒傷后增生

8、性瘢痕組織和其同體對照正常皮膚組織進(jìn)行原代分離、培養(yǎng)獲得了增生性瘢痕來源的成纖維細(xì)胞和正常皮膚來源的成纖維細(xì)胞，然后利用Real-Time PCR技術(shù)和Western Blotting技術(shù)分別從mRNA水平和蛋白水平檢測了增生性瘢痕來源的成纖維細(xì)胞和正常皮膚來源的成纖維細(xì)胞中ITGB4BP的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ITGB4BP基因無論是mRNA水平還是蛋白水平均低表達(dá)于增生性瘢痕來源的成纖維細(xì)胞。
　　 同時我們檢測了正常成人皮膚和增生

9、性瘢痕皮膚中ITGB4BP的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在正常成人皮膚和增生性瘢痕皮膚中ITGB4BP主要表達(dá)在表皮層的基底細(xì)胞的胞漿中，同時ITGB4BP在正常皮膚真皮層的成纖維細(xì)胞中也有表達(dá)，主要分布在細(xì)胞胞漿中，但在增生性瘢痕皮膚真皮層成纖維細(xì)胞中卻未見明顯陽性細(xì)胞的表達(dá)。因此提示胞漿ITGB4BP(+)的成纖維細(xì)胞是生理成纖維細(xì)胞，而胞漿ITGB4BP(-)細(xì)胞是纖維化型成纖維細(xì)胞。
　　 2、ITGB4BP抑制肌成纖維細(xì)胞的生物學(xué)

10、功能
　　 ITGB4BP強(qiáng)制高表達(dá)于增生性瘢痕來源的成纖維細(xì)胞后，我們利用Real-Time PCR技術(shù)和Western Blotting技術(shù)分別從mRNA水平和蛋白水平檢測α-SMA(α-平滑肌肌動蛋白)、TGF-β1(轉(zhuǎn)移生長因子-β1)、CollagenⅠ(Ⅰ型膠原)的變化，并且利用FPCL(Fibroblasts Populated Collagen Lattice，成纖維細(xì)胞膠原網(wǎng)架系統(tǒng))模型檢測膠原收縮。結(jié)果表明：

11、ITGB4BP能夠抑制α-SMA、TGF-β1和CollagenⅠ的表達(dá)，同時抑制FPCL模型中凝膠的收縮。提示ITGB4BP具有使肌成纖維細(xì)胞去分化作用。
　　 我們利用TGF-β1抗體封閉TGF-β1信號通路后，利用FPCL模型觀察到ITGB4BP仍能抑制膠原的收縮，提示ITGB4BP抑制膠原收縮存在非TGF-β1依賴機(jī)制，因此我們利用免疫共沉淀釣出ITGB4BP相互作用蛋白，通過質(zhì)譜技術(shù)篩選出ITGB4BP相互作用蛋白α3

12、-Catenin。
　　 3、ITGB4BP抑制纖維化動物模型的纖維增生
　　 由于目前缺乏理想的增生性瘢痕動物模型，所以我們利用大鼠背部皮膚線性切口模型和CCL4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化動物模型來觀察創(chuàng)面愈合后肉芽組織的多少和肝纖維化后膠原纖維的比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在線性切口模型中ITGB4BP在創(chuàng)傷后第7天能明顯減少大鼠背部皮膚線性切口后的瘢痕面積，在肝纖維化模型中ITGB4BP能有效降低大鼠肝纖維化后膠原的比例。
　　

13、終上所述，本課題首先根據(jù)ITGB4BP在正常皮膚組織和增生性瘢痕組織中的表達(dá)分布特點(diǎn)，提示胞漿ITGB4BP陽性的成纖維細(xì)胞是生理型成纖維細(xì)胞，參與形成正常皮膚的真皮層，胞漿ITGB4BP陰性的細(xì)胞是纖維化型成纖維細(xì)胞，參與形成增生性瘢痕的真皮層。其次通過強(qiáng)制高表達(dá)ITGB4BP，從體外實驗初步闡明了ITGB4BP一方面特異性下調(diào)TGF-β1蛋白的表達(dá)，抑制TGF-β1-Smad信號的傳導(dǎo)，使增生性瘢痕內(nèi)肌成纖維細(xì)胞的表型發(fā)生逆轉(zhuǎn)，表達(dá)

14、α-SMA、分泌Ⅰ型膠原降低，細(xì)胞收縮能力受到抑制，從而抑制增生性瘢痕的形成。另一方面作用于胞漿中的α3-Catenin參與調(diào)節(jié)β-catenin信號通路，影響增生性瘢痕相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯和細(xì)胞-細(xì)胞粘附。最后通過體內(nèi)纖維化動物模型證明ITGB4BP能相對量地(非絕對量)控制纖維化，縮短創(chuàng)面愈合時間。因此，我們研究提示ITGB4BP通過TGF-β1信號通路和β-Catenin信號通路抑制肌成纖維細(xì)胞的生物學(xué)功能，逆轉(zhuǎn)成纖維細(xì)胞向肌成纖