成纖維細(xì)胞激活蛋白在燙傷創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中的表達(dá)及意義.pdf

1、研究背景：成纖維細(xì)胞激活蛋白(FAPa)是1986年由國(guó)外的學(xué)者Rettig等應(yīng)用單克隆抗體F19（用體外培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞免疫小鼠獲得）從人類惡性黑色素瘤細(xì)胞株LOX當(dāng)中識(shí)別的一種膜結(jié)合糖蛋白，它特異性表達(dá)活化的成纖維細(xì)胞(FB)膜上，在正常成人靜息的FB上通常不表達(dá)或者表達(dá)水平很低。提示:FAPa是活化FB表面的標(biāo)志物，在控制FB生長(zhǎng)及胚胎發(fā)育、組織修復(fù)和上皮性腫瘤的演進(jìn)過(guò)程中可能起一定的作用。
　　 近三十年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有關(guān)

2、FAPa的研究工作逐漸開(kāi)展，大部分集中在組織器官纖維化和上皮性腫瘤的研究領(lǐng)域。大量的研究報(bào)道，F(xiàn)APa在大多數(shù)上皮性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用，其作用機(jī)制有以下幾種可能:(1)發(fā)揮其酶的功能，直接溶解與其相鄰的細(xì)胞外基質(zhì)成分，協(xié)助腫瘤細(xì)胞的侵襲和參與腫瘤組織的重塑;(2)解離與基質(zhì)蛋白結(jié)合的生長(zhǎng)因子，使之發(fā)揮促生長(zhǎng)作用;(3)參與腫瘤微血管的生成。目前FAPa已成為腫瘤治療的新型靶目標(biāo)，成為腫瘤臨床與基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)，相關(guān)研究工作正

3、在有序地開(kāi)展，其中的不足之處仍在不斷改進(jìn)。
　　 FB作為重要的組織修復(fù)細(xì)胞，以活化的形式參與創(chuàng)面修復(fù)的各個(gè)階段，在創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中起重要的作用。FAPa作為活化FB表面的標(biāo)志物，目前有關(guān)FAPa在創(chuàng)面修復(fù)與組織重建的研究領(lǐng)域開(kāi)展較少，目前雖然已經(jīng)明確FAPa在創(chuàng)面修復(fù)的早期階段及后期的瘢痕組織中均有不同程度的表達(dá)，但是FAPa在創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)特點(diǎn)、生理作用及調(diào)控機(jī)制，迄今未見(jiàn)系統(tǒng)的研究和闡明。
　　 研究目的：

4、
　　 1.觀測(cè)FAPa在大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)特點(diǎn)。
　　 2.觀測(cè)FAPa在成人病理性瘢痕組織中的表達(dá)特點(diǎn)。
　　 3.初步探討FAPa在燙傷創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中可能的作用。
　　 材料與方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:健康成年清潔級(jí)Wistar大鼠共48只，雌雄不限，體質(zhì)量200～220g（南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）。按統(tǒng)計(jì)學(xué)分組要求，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組6只，實(shí)驗(yàn)組

5、42只。實(shí)驗(yàn)組分為燙傷后6h、12h，1d、3d、7d、14d、21d7個(gè)分組，每分組6只。
　　 2.深Ⅱ度燙傷模型的建立與組織獲取:Wistar大鼠燙傷模型借鑒文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，于實(shí)驗(yàn)前一天背部脫毛，0.3％戊巴比妥鈉(1 ml/kg)腹腔注射麻醉。室溫下，將盛有56ml去離子水，直徑約3.0cm的燒瓶放入恒溫水箱中，加熱至燒瓶?jī)?nèi)的溫度為95℃時(shí)取出燒瓶，在溫度為90℃時(shí)，輕放在大鼠背部皮膚上15s，造成直徑約3.0cm大小的圓形深

6、Ⅱ度燙傷創(chuàng)面（經(jīng)病理驗(yàn)證為深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面）。傷后大鼠置室溫25℃環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食，每天更換創(chuàng)面敷料一次。分別在傷后預(yù)定時(shí)間斷頭處死，取創(chuàng)面中央處1.0 cm×1.0cm全層皮膚組織，1/2放入4％中性多聚甲醛中固定，用于免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，另1/2組織置于-80℃冰箱保存，用于Western blotting檢測(cè)試驗(yàn)。對(duì)照組背部脫毛后直接斷頭處死，取與實(shí)驗(yàn)組大鼠相同部位同等大小皮膚組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　 3.病理性瘢痕

7、組織的獲取:選擇南方醫(yī)院燒傷科因四肢深Ⅱ度燙傷后形成病理性瘢痕，需要手術(shù)治療的患者6例（診斷依靠病史及病理檢查，病變局部皮膚無(wú)破潰，患者無(wú)全身疾病），男女各半，年齡18-60歲，瘢痕形成時(shí)間10-14個(gè)月。在征得病人及其家屬同意后，手術(shù)切除病理性瘢痕的同時(shí)，在其周邊取少許正常皮膚組織作對(duì)照，標(biāo)本置于-80℃冰箱保存，用于Western blotting檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。
　　 4.觀測(cè)方法:應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)和Western blot

8、ting技術(shù)對(duì)FAPa的表達(dá)進(jìn)行定位和半定量檢測(cè)。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)大鼠燙傷創(chuàng)面FAPa的灰度值行正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布、方差齊性。對(duì)大鼠燙傷創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)FAPa的灰度值的統(tǒng)計(jì)分析采用one-way ANOVA，進(jìn)一步多重比較采用SNK-q檢驗(yàn);成人病理性瘢痕組織及其周圍正常皮膚組織FAPa灰度值的統(tǒng)計(jì)分析，采用配對(duì)t檢驗(yàn)。顯著性檢

9、驗(yàn)水平a=0.05，當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1.免疫組織化學(xué)技術(shù)測(cè)得FAPa(+)的成纖維細(xì)胞被DAB染成棕色定位在創(chuàng)面真皮血管以及新生血管的血管壁和血管周圍。
　　 2.以β-actin為內(nèi)參，Western blotting技術(shù)測(cè)得對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)大鼠背部皮膚組織FAPa的灰度值分別為31.67±3.20，84.67±8.71，106.00±11.75,118.33

10、±13.44,117.33±8.62,140.33±15.92,106.17±15.77,79.83±9.30。實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)FAPa的灰度值與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)FAPa灰度值的總體均數(shù)不全相等，其中12h與1d，1d與3d比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余時(shí)間點(diǎn)FAPa的灰度值與相鄰時(shí)間點(diǎn)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.以β-actin為內(nèi)參，Western blotting技術(shù)測(cè)得成人正常皮膚組織

11、與病理性瘢痕組織中FAPa的灰度值分別為18.00±7.87，47.17±10.09，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.FAPa在大鼠正常皮膚組織中也有表達(dá)，深Ⅱ度燙傷后6h，F(xiàn)APa的表達(dá)量已明顯增多，6h以后FAPa的表達(dá)量逐漸增多，并在燙傷后第7d達(dá)到高峰，7d后FAPa的表達(dá)量逐漸減少，至傷后第21d FAPa仍有較高水平的表達(dá)。
　　 2.FAPa在成人正常皮膚與病理性瘢痕