P311和ITGB4BP間相互作用及其對成纖維細胞生成細胞外基質(zhì)的影響.pdf

1、機體組織由細胞和細胞外基質(zhì)構(gòu)成(extracellularmatrix，ECM)，正常情況下細胞外基質(zhì)的合成與降解維持在動態(tài)平衡中。機體發(fā)生病變比如創(chuàng)傷愈合時，平衡受到破壞，如果細胞外基質(zhì)降解大于合成，容易引起創(chuàng)傷難愈甚或不愈合，反之則造成纖維化，如在皮膚常由于過度纖維化而導(dǎo)致增生性瘢痕。細胞外基質(zhì)生成主要受成纖維細胞所調(diào)節(jié)，因此能夠影響成纖維細胞功能的分子機制也常常被認為是調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)生成的重要因素。 我們在前期利用基因芯片

2、技術(shù)確定p311(GenBankIDhsu36189)基因顯著高表達于增生性瘢痕組織中。隨后的文獻復(fù)習(xí)發(fā)現(xiàn)p311基因編碼的蛋白產(chǎn)物P311在創(chuàng)傷愈合中能夠通過調(diào)節(jié)成纖維細胞而影響細胞外基質(zhì)。其主要原因在于創(chuàng)傷愈合時，P311高表達于活化的成纖維細胞和肌成纖維細胞中，并能夠從mRNA水平上抑制細胞轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶2和9(MMP-2、MMP-9)以及膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ的表達，因此被認為可能具有抑制纖維化的功能

3、。為探索P311調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)表達的分子機制，利用酵母雙雜交系統(tǒng)，我們篩選出一個P311的相互作用蛋白--整合素β4結(jié)合蛋白(ITGB4BP，GenBankIDNM_002212)。本課題擬在原來研究的基礎(chǔ)上，進一步明確P311和ITGB4BP間的相互作用，并探討P311和ITGB4BP的相互作用對成纖維細胞生成細胞外基質(zhì)的影響。本文設(shè)計并進行了如下實驗研究： 1.P311與ITB4BP間相互作用蛋白的確定 1.1免疫共

4、沉淀實驗確定P311和ITGB4BP間相互作用：首先從質(zhì)粒pDsRed1-N1、pP311-DsRed、pEGFP-N2和pITGB4BP-EGFP中經(jīng)酶切獲取編碼DsRed1、P311-DsRed、EGFP和ITGB4BP-EGFP的基因序列一一構(gòu)建至腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV的多克隆位點區(qū)(MCS)，隨后與pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183中進行同源重組后獲得四個腺病毒載體，分別命名為pAdEasy-shuttle

5、-DsRed、pAdEasy-shuttle-P311-DsRed、pAdEasy-shuttle-EGFP和pAdEasy-shuttle-ITGB4BP-EGFP，并轉(zhuǎn)染HEK293細胞包裝、擴增，將獲得的腺病毒依次命名為Ad-DsRed、Ad-P311-DsRed、Ad-EGFP和Ad-ITGB4BP-EGFP。取第3-4代腺病毒感染不同分組中的HEK293細胞后，提取細胞裂解物上清，利用免疫沉淀技術(shù)證實P311和ITGB4BP能

6、夠在細胞裂解液內(nèi)形成復(fù)合物，表明二者間存在相互作用。 1.2熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)驗證P311和ITGB4BP間相互作用對肺腺癌組織石蠟切片用兔抗人P311抗體和小鼠抗人ITGB4BP抗體孵育后，同時用Cy3標記的抗兔IgG抗體和Cy5標記的抗小鼠IgG抗體進行檢測，激光共聚焦顯微鏡下結(jié)合受體光漂白技術(shù)進行FRET實驗。結(jié)果證實當受體分子即Cy5標記的ITGB4BP被漂白后，供體Cy3標記的P311熒光強度則明顯增強，表明

7、P311和ITGB4BP在細胞內(nèi)存在相互作用。 2.P311和ITGB4BP的表達變化對成纖維細胞產(chǎn)生細胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)作用 在原代培養(yǎng)的人增生性瘢痕成纖維細胞內(nèi)采用慢病毒RNA干擾技術(shù)，穩(wěn)定下調(diào)P311和ITGB4BP的表達，同時在原代培養(yǎng)的人正常成纖維細胞采用腺病毒技術(shù)過表達P311和ITGB4BP,隨后對細胞培養(yǎng)上清利用ELISA實驗對MMP-9、TGF-β1、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達在蛋白水平上進行檢測。結(jié)果表明：

8、高表達ITGB4BP具有下調(diào)成纖維細胞生成MMP-9、TGF-β1和Ⅰ型膠原的作用，抑制ITGB4BP的表達則具有促進MMP-9、TGF-β1和Ⅰ型膠原表達和抑制Ⅲ型膠原生成的作用，故在功能上推測ITGB4BP可能以抑制纖維化為主；抑制P311的表達具有下調(diào)MMP-9、Ⅰ和Ⅲ型膠原的作用，高表達P311則抑制成纖維細胞生成TGF-β1，因此P311可能作為下游負調(diào)信號參與ITGB4BP調(diào)節(jié)MMP-9和Ⅰ型膠原表達的過程，作為正信號協(xié)同參

9、與ITGB4BP抑制成纖維細胞TGF-β1的表達；此外，P311和ITGB4BP表達抑制后均能抑制成纖維細胞生成Ⅲ型膠原，二者間可能具有協(xié)同作用。 綜上所述，本課題首先明確P311和ITGB4BP間存在相互作用，并進一步明確了P311和ITGB4BP之間的相互作用在調(diào)節(jié)成纖維細胞生成細胞外基質(zhì)的過程中以ITGB4BP的功能占主導(dǎo)，高表達ITGB4BP具有抑制纖維化相關(guān)的細胞外基質(zhì)的作用，P311可能作為下游信號參與其中。因此，P