膠原模擬多肽及其對成纖維細(xì)胞粘附作用的研究.pdf

1、膠原是胞外基質(zhì)的主要成分，具有獨(dú)特的三螺旋結(jié)構(gòu)。它不僅對組織和器官起支持和保護(hù)作用，還參與介導(dǎo)許多生物學(xué)過程。這些生物學(xué)功能是通過細(xì)胞粘附分子與膠原特征結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合來實現(xiàn)的。深入研究膠原特征結(jié)構(gòu)與細(xì)胞的相互作用，是膠原作為生物活性材料應(yīng)用以及開發(fā)人工類膠原生物材料的重要基礎(chǔ)。膠原模擬多肽(CMP)可以模擬膠原的特征結(jié)構(gòu)，為研究膠原的結(jié)構(gòu)和功能提供了一個新方法。
　　 本研究設(shè)計合成了包含類膠原重復(fù)序列(Pro-Hyp-Gl

2、y)n的CMP21、含整合素α2βi識別序列Gly-Phe-Hyp-Gly-Glu-Arg(GFOGER)的CMP9以及同時包含以上兩種序列的CMP27。研究了Ⅰ型膠原和膠原模擬多肽的三螺旋結(jié)構(gòu)及其熱穩(wěn)定性，觀察了膠原模擬多肽對成纖維細(xì)胞的粘附作用，闡明了兩種序列對細(xì)胞粘附的不同影響作用。主要研究工作如下：
　　 1．膠原及膠原模擬多肽三螺旋結(jié)構(gòu)及熱穩(wěn)定性研究
　　 通過圓二色譜(CD)表征了膠原及膠原模擬多肽的三螺旋結(jié)

3、構(gòu)及其熱穩(wěn)定性，CD譜結(jié)果顯示，僅有整合素識別位點(diǎn)序列的CMP9不具有三螺旋結(jié)構(gòu)，而CMP21和CMP27能自發(fā)形成類似膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)。熱穩(wěn)定性研究證實，膠原溶液經(jīng)溫度誘導(dǎo)后發(fā)生“螺旋—解旋”的熱變性過程，該過程不可逆；CMP21和CMP27溶液溫度升高后構(gòu)象連續(xù)發(fā)生變化，在一定條件下其熱變性過程實現(xiàn)可逆恢復(fù)，發(fā)生“螺旋—解旋—復(fù)旋”的變化過程。
　　 2．膠原及膠原模擬多肽細(xì)胞毒性評價
　　 用CCK-8法考察CMP

4、及膠原溶液對L929細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果顯示，CMP溶液對已貼壁成纖維細(xì)胞生長無抑制作用，未發(fā)生明顯的細(xì)胞毒性反應(yīng)，其中CMP27組對L929細(xì)胞生長有一定的促進(jìn)作用。
　　 3．物理吸附膠原模擬多肽對成纖維細(xì)胞粘附的影響
　　 通過物理吸附固定CMP，利用細(xì)胞粘附、競爭抑制、熒光染色等實驗證實，三種包被CMP的基底均能在一定程度上促進(jìn)細(xì)胞粘附、生長，具有良好的細(xì)胞粘附率和細(xì)胞附著形態(tài)，其中CMP27具有更好的促粘附效果

5、，可觀察到大量的應(yīng)力纖維及偽足，粘附效果與I型膠原相近。由此認(rèn)為，膠原三螺旋結(jié)構(gòu)對細(xì)胞粘附有促進(jìn)作用，GFOGER序列對細(xì)胞偽足生成及應(yīng)力纖維形成有支持作用。研究結(jié)果初步證實，膠原三螺旋結(jié)構(gòu)與整合素識別位點(diǎn)序列共同作用促進(jìn)成纖維細(xì)胞粘附。
　　 4．殼聚糖膜共價偶聯(lián)膠原模擬多肽對成纖維細(xì)胞粘附的影響
　　 以3-馬來酰亞胺基苯甲酸琥珀酰亞胺酯(MBS)為連接臂，將殼聚糖膜與CMP共價偶聯(lián)。利用核磁共振(1H-NMR)與X

6、-射線光電子能譜(XPS)對樣品進(jìn)行了表征，證實多肽與MB-殼聚糖膜共價偶聯(lián)成功。細(xì)胞粘附等實驗說明，MB-殼聚糖濃度對成纖維細(xì)胞粘附有一定影響，當(dāng)MB-殼聚糖濃度為3ng/mm2和6ng/mm2時，粘附效果較好。MB-殼聚糖膜偶聯(lián)CMP后對L929細(xì)胞粘附的促進(jìn)作用明顯增強(qiáng)，偶聯(lián)CMP27的效果較好，可以觀察到長勢良好的應(yīng)力纖維與微絨毛，其粘附效果與吸附膠原的基底近似。以上結(jié)果進(jìn)一步證實，膠原三螺旋結(jié)構(gòu)及整合素識別位點(diǎn)序列共同作用促進(jìn)