IL-13對成纖維細(xì)胞膠原蛋白合成的影響及其分子調(diào)控機制.pdf

1、目的和意義: 增生性瘢痕或瘢痕疙瘩是一種皮膚纖維化過程，可限制活動，影響皮膚的美觀和功能，是皮膚組織燒傷、創(chuàng)傷修復(fù)后，由于全身和局部因素的影響，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度分泌沉積、大量纖維組織增生、膠原降解減少、血管大量生成，包括成纖維細(xì)胞在內(nèi)的組織修復(fù)細(xì)胞異常增殖分化而形成的。在纖維化的起始階段，各種始動因素促使多種細(xì)胞因子的釋放。細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在介導(dǎo)炎癥及其后的纖維化過程中所起的作用日益受到重視。有研究表明，在纖維化形成過程

2、中存在1型輔助性T細(xì)胞(Th1)和2型輔助性T細(xì)胞(Th2)細(xì)胞因子間的失衡，即Th1/Th2失衡，從而促進了成纖維細(xì)胞激活、增生，細(xì)胞外基質(zhì)沉積。Th1型細(xì)胞因子包括IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-18和腫瘤壞死因子-β(TNF-β)，Th2型細(xì)胞因子包括IL-4、IL-5、IL-10、IL-13和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)。Th1型和Th2型細(xì)胞因子應(yīng)答在纖維化方面的相反效應(yīng)(即Th1型細(xì)胞因子的抗纖維化效應(yīng)和Th2

3、型細(xì)胞因子的促纖維化效應(yīng))已被近來的基因芯片技術(shù)所證實。白細(xì)胞介素13(IL-13)是一種多效能的免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，主要由激活的輔助T淋巴細(xì)胞(Th2)產(chǎn)生，是許多由Ⅱ類細(xì)胞因子決定的病理過程的關(guān)鍵誘導(dǎo)物。它能調(diào)節(jié)炎癥、黏液產(chǎn)生、組織重建和纖維化，它在皮膚纖維化、肺纖維化、肝纖維化等多種纖維化疾病的發(fā)生機制中起重要作用，也是多種纖維化疾病的重要治療靶點。為研究IL-13在瘢痕形成過程中的潛在作用，本研究探討IL-13對瘢痕成纖維細(xì)胞的

4、膠原合成作用及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，觀察IL-13是否促進瘢痕成纖維細(xì)胞膠原基因的轉(zhuǎn)錄和膠原蛋白的合成，這一過程是否通過IL-13結(jié)合瘢痕成纖維細(xì)胞膜上的IL-13受體，從而激活JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，將胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子STAT6蛋白磷酸化，后轉(zhuǎn)入核內(nèi)與膠原靶基因結(jié)合，上調(diào)膠原基因的轉(zhuǎn)錄，促進膠原蛋白的合成。另外觀察酪氨酸酶抑制劑A771726和抗纖維化藥物干擾素-γ是否阻斷IL-13的促瘢痕成纖維細(xì)胞的膠原合成作用，從而為IL

5、-13纖維化機制的研究和瘢痕發(fā)生機制的研究增添新內(nèi)容，同時為新方法用于臨床瘢痕治療奠定理論基礎(chǔ)和提供實驗依據(jù)。 研究內(nèi)容和方法: 1.IL-13對成纖維細(xì)胞的膠原合成作用的影響：體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，繪制細(xì)胞生長曲線觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。細(xì)胞分為實驗組和對照組，實驗組加入IL-13(100μg/L)，對照組不加細(xì)胞因子，HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)，膠原纖維的特殊染色觀察膠原纖維的形成，MTT法觀察不同濃度的IL-13對成纖維細(xì)胞增殖

6、作用的影響。IL-13作用24、48、72小時后，羥脯氨酸檢測IL-13對成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白的影響，RT-PCR觀察IL-13對成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原α1基因(COL1A1)mRNA水平表達的影響，Western-Blotting觀察IL-13對成纖維細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白的影響。 2.IL-13對成纖維細(xì)胞作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究：RT-PCR檢測成纖維細(xì)胞IL-13受體僅α1的表達，Western-Blotting觀察IL-1

7、3作用成纖維細(xì)胞1、2、4、8小時后轉(zhuǎn)錄因子STAT6磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白的表達。 3.酪氨酸酶抑制劑A771726阻斷IL-13對成纖維細(xì)胞的促膠原蛋白合成作用：MTT法觀察不同濃度的A771726對成纖維細(xì)胞的增殖作用的影響。成纖維細(xì)胞分為實驗組和實驗對照組，實驗對照組加入IL-13(100μg/L)，實驗組加入A771726(50μM)和IL-13(100μg/L)，作用24、48、72小時后，羥脯氨酸檢測A77172

8、6對IL-13促進成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白的影響，RT-PCR觀察A771726對IL-13促進成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原α1基因mRNA水平表達的影響，Western-Blotting觀察A771726對IL-13促進成纖維細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白的影響。 4.干擾素-γ抑制IL-13對成纖維細(xì)胞的促膠原蛋白合成作用：MTT法觀察不同濃度的干擾素-γ對成纖維細(xì)胞的增殖作用的影響。成纖維細(xì)胞分為實驗組和空白對照組，實驗組加入干擾素-γ(4×1

9、05U/L)和IL-13(100μg/L)，作用24、48、72小時后，羥脯氨酸檢測干擾素-γ是否抑制IL-13促進成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白，RT-PCR觀察干擾素-γ是否抑制IL-13促進成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原α1基因mRNA水平的表達，Western-Blotting觀察干擾素-γ是否抑制IL-13促進成纖維細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白。 結(jié)果: 1.IL-13促進成纖維細(xì)胞的膠原合成作用：HE染色觀察到實驗組細(xì)胞增長旺盛，有明顯

10、的交叉重疊現(xiàn)象，胞漿豐富，但大體形態(tài)與對照組細(xì)胞無明顯差別；膠原纖維特殊染色觀察到實驗組膠原纖維合成增加；MTT法觀察到IL-13促進瘢痕成纖維細(xì)胞增殖；羥脯氨酸檢測實驗組細(xì)胞培養(yǎng)上清液分泌總膠原蛋白含量在IL-13作用48h、72h后顯著高于對照組；RT-PCR檢測到成纖維細(xì)胞表達Ⅰ型膠原α1基因，且IL-13作用48h、72h后，表達顯著增強；Western Blotting檢測到成纖維細(xì)胞表達I型膠原蛋白，且IL-13作用48h、

11、72h后，表達顯著增強。 2.IL-13介導(dǎo)成纖維細(xì)胞STAT6磷酸化：RT-PCR檢測到成纖維細(xì)胞表達IL-13受體α1，Western-Blotting觀察IL-13作用成纖維細(xì)胞1、2、4、8小時后均有非磷酸化STAT6蛋白的表達，IL-13作用2h后磷酸化STAT6蛋白表達最強，4h后衰減。 3.酪氨酸酶抑制劑A771726阻斷IL-13對成纖維細(xì)胞的促膠原蛋白合成作用：MTT法觀察到A771726可抑制成纖維細(xì)

12、胞的增殖，羥脯氨酸檢測實驗組48h組和72h組成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白的含量顯著低于實驗對照組，RT-PCR觀察到實驗組48h組和72h組成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原α1基因mRNA表達水平顯著低于實驗對照組，Western-Blotting觀察到實驗組48h組和72h組成纖維細(xì)胞分泌I型膠原蛋白的水平顯著低于空白對照組。 4.干擾素-γ抑制IL-13對成纖維細(xì)胞的促膠原蛋白合成作用：MTT法觀察到干擾素-γ可抑制成纖維細(xì)胞的增殖，羥脯氨酸

13、檢測實驗組48h組和72h組成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白的含量顯著低于空白對照組，RT-PCR觀察到實驗組48h組和72h組成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原α1基因mRNA表達水平顯著低于空白對照組，Western-Blotting觀察到實驗組48h組和72h組成纖維細(xì)胞分泌I型膠原蛋白的水平顯著低于空白對照組。 結(jié)論: IL-13促進成纖維細(xì)胞的增殖，IL-13促進成纖維細(xì)胞分泌膠原，IL-13促進成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原α1基因mRNA水平和