激動TGR5對乳小鼠心肌成纖維細胞分泌膠原蛋白的影響及其機制.pdf

1、目的：研究激動TGR5對乳小鼠心肌成纖維細胞膠原蛋白分泌的影響，并探討可能存在的機制。
　　方法：⑴原代培養(yǎng)乳小鼠心肌成纖維細胞(cfs)及鑒定:取3-5天乳小鼠，處死后取心臟的心尖部分，胰酶消化后用差速貼壁法培養(yǎng)7-10天左右傳代，取3代細胞用特異性抗體熒光免疫法鑒別。⑵熒光定量PCR檢測心肌成纖維細胞上TGR5 mRNA表達:提取生長良好的3代心肌成纖維細胞的RNA，同時分別提取肝臟、脾臟和心臟組織的RNA用于對比，檢測RNA

2、的濃度及純度后，進行cDNA的反轉錄合成，委托上海生工生物有限公司設計、合成TGR5引物，上機進行目的基因的定量檢測。⑶TGR5過表達慢病毒的制備與包裝:利用限制性內(nèi)切酶消化后得到線性化載體。PCR擴增制備目的基因片段。以GV358作為工具載體質粒，同Helper1.0質粒及Helper2.0質粒共轉染293T細胞，48-72 h后進行病毒收獲，離心濃縮和純化后得到高滴度的慢病毒，分裝保存，并進行病毒質量檢測。⑷TGR5過表達慢病毒感染

3、心肌成纖維細胞，上調細胞膜上TGR5表達:取3代生長良好的心肌成纖維細胞，分為正常細胞組、空病毒組、TGR5過表達慢病毒組(cfs-v)，孵育24h，熒光顯微鏡下觀察熒光顯色并用PCR法檢測細胞膜上TGR5 mRNA的表達變化，用Western Blot法檢測細胞內(nèi)TGR5的蛋白水平。⑸小鼠膠原蛋白酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測膠原蛋白Ⅰ型和Ⅲ型:用吸管分別吸取各組培養(yǎng)基于10ml離心管中，離心后得到上清液，加入酶標板中，經(jīng)溫育、洗滌、顯色、終

4、止、測定得到各組OD值用excel、SPSS等軟件分析數(shù)據(jù)。⑹cAMP試劑盒檢測胞內(nèi)cAMP含量:胰酶消化收集上述各組細胞，經(jīng)反復凍存，使細胞內(nèi)成分完全裂解，離心后取上清液，加入酶標板中，經(jīng)溫育、洗滌、加酶、顯色、終止、測定得到各組OD值用excel、SPSS等軟件分析數(shù)據(jù)。⑺探索激動TGR5影響膠原蛋白分泌的機制:實驗分組:空白組（cfs組）；對照組（cfs-v組）；cfs-v+nomilin組；cfs-v+nomilin+BIRB-

5、796組。取2代cfs及cfs-v接種于6孔板上，正常培養(yǎng)2天，當貼璧細胞達到90％時加入含BIRB-796的培養(yǎng)基（BIRB-796終濃度為10μmol/l）干預1小時，然后加入諾米林(nomilin)（50mmol/l，20μl/孔）作用24小時。分別提取上述各組細胞的總蛋白及核蛋白，運用考馬斯亮藍染色法測定得到蛋白濃度，以GAPDH為內(nèi)參，將處理好的蛋白質樣品進行分離、轉膜、封閉，依次孵育一抗和二抗、顯色、成像后，將獲得圖像用圖像

6、處理軟件ImageJ測定并分析條帶灰度值以檢測p-P38、Nrf2、HO-1的蛋白的表達水平。
　　結果：①原代培養(yǎng)乳小鼠心肌成纖維細胞成功。②熒光定量PCR結果顯示:cfs上TGR5 mRNA的表達量明顯少于心臟、肝臟和脾臟，差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。③成功制備TGR5過表達慢病毒:克隆測序結果證實目標基因成功連接入酶切載體。檢測病毒滴度為2E+8TU/ml。④成功建立過表達TGR5的心肌成纖維細胞模型：熒光顯微鏡下可見感

7、染TGR5過表達慢病毒的心肌成纖維細胞(cfs-v)有大量熒光表達，感染率為90％；RT-PCR檢測結果顯示:cfs-v上TGR5 mRNA表達量較cfs明顯增多，P＜0.05；Western Blot結果顯示:cfs-v內(nèi)TGR5的蛋白含量較cfs明顯增多，P＜0.05。5、cAMP試劑盒檢測胞內(nèi)cAMP含量的結果顯示:cfs-v+nomilin組細胞內(nèi)cAMP含量較cfs組及cfs-v組均明顯升高，P值均＜0.05。6、ELISA試

8、劑盒檢測膠原蛋白Ⅰ型和Ⅲ型的結果顯示:cfs-v+nomilin組細胞分泌的Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白較cfs組及cfs-v組均明顯降低，P值均＜0.05。cfs-v+nomilin+BIRB-796組與cfs-v+nomilin組相比，膠原蛋白Ⅰ型和Ⅲ的含量增多，P＜0.05。7、Western Blot法檢測各組內(nèi)p-P38、Nrf2及HO-1的蛋白水平，結果顯示:cfs-v+nomilin組細胞內(nèi)p-P38、Nrf2及HO-1的蛋白水平較