RNAi抑制病理性瘢痕成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原的合成.pdf

1、增生性瘢痕(Hypertrophicscar,HS)與瘢痕疙瘩(Keloid，K)是常見的病理性瘢痕，一般認(rèn)為它們是由創(chuàng)傷引起，以膠原等大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)的過度產(chǎn)生和沉積為特征的皮膚纖維增生性疾病，其發(fā)病率較高，且病理性瘢痕形成后無論在功能上還是外觀上都給患者身心健康帶來極大的危害。病理性瘢痕的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全清楚，雖然人們對(duì)其病因及治療作了大量的研究，但至今仍未獲得有效的治療手段。隨著

2、基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，使得基因治療成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域全新的治療手段，特別是前幾年才被發(fā)現(xiàn)的RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)即成為科學(xué)界的新寵，并為分子醫(yī)學(xué)帶來翻天覆地的變化。本文將采用以質(zhì)粒為載體的RNAi技術(shù)，從基因治療的角度，以體外培養(yǎng)的人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，針對(duì)病理性瘢痕形成與發(fā)展的重要環(huán)節(jié)-膠原代謝開展實(shí)驗(yàn)。探索病理性瘢痕基因治療的新策略。 [方法]根據(jù)人Ⅰ型膠原α1鏈(COL

3、1α1)基因序列及二級(jí)結(jié)構(gòu)特征，借助網(wǎng)上RNAi設(shè)計(jì)工具尋找4個(gè)干擾位點(diǎn)，并經(jīng)過BLAST確定與其它基因不存在同源性。人工合成4對(duì)正反義脫氧寡核苷酸鏈，退火，定向克隆至含小鼠mU6啟動(dòng)子的真核表達(dá)質(zhì)粒載體pmU6中。電泳法初步篩選陽(yáng)性重組克隆，并經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證重組克隆質(zhì)粒插入序列的正確性。抽提和純化已鑒定的質(zhì)粒，根據(jù)260nm紫外光吸收值及其與280nm紫外光吸收值的比值計(jì)算重組質(zhì)粒的濃度和純度。MTT法觀察質(zhì)粒載體與及轉(zhuǎn)染試劑對(duì)成纖

4、維細(xì)胞(FB)生長(zhǎng)增殖的影響。通過將重組質(zhì)粒與綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1在脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染的方法，熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。RT-PCR檢測(cè)RNAi對(duì)COL1α1基因mRNA水平的影響，以羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒測(cè)定Ⅰ型膠原合成的變化。 [結(jié)果]成功構(gòu)建了針對(duì)人COL1α1基因的shRNA表達(dá)質(zhì)粒，并且各陽(yáng)性克隆均能正確測(cè)序，DNA測(cè)序結(jié)果表明各重組質(zhì)粒的序列符合預(yù)期要求。抽

5、提和純化后，各質(zhì)粒的純度和濃度均通過測(cè)定，能滿足轉(zhuǎn)染的要求。較高的細(xì)胞接種密度(6孔板5.0×105/孔)適合轉(zhuǎn)染且LipofectamineTM2000及質(zhì)粒對(duì)成纖維細(xì)胞的毒性不明顯。經(jīng)LipofectamineTM2000介導(dǎo)共轉(zhuǎn)染后，shRNA表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率都比較高，達(dá)50％左右。半定量RT-PCR技術(shù)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，各shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組COL1α1mRNA轉(zhuǎn)錄水平有不同程度的下調(diào)。與對(duì)照組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RNAi作用效果

6、經(jīng)羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒測(cè)定膠原水平證實(shí)。 [結(jié)論]成功構(gòu)建了4個(gè)針對(duì)人Ⅰ型膠原α1鏈(COL1α1)基因的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒。6孔板接種5.0×105細(xì)胞/孔的密度最適于轉(zhuǎn)染。由LipofectamineTM2000介導(dǎo)各質(zhì)粒的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率均較高。所構(gòu)建的shRNA表達(dá)框架質(zhì)粒能特異且有效地下調(diào)COL1α1基因的表達(dá)，從而成功抑制了病理性瘢痕成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原的合成。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示RNA干擾技術(shù)可作為病理性瘢痕基因治療研究