成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21對(duì)骨骼肌肌纖維類型的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、肌纖維是構(gòu)成肌肉組織的基本單位，其組成決定肉品質(zhì)。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21（Fibroblast growth factor，F(xiàn)GF21）是一種代謝調(diào)節(jié)因子，在肌肉中有表達(dá)，但其對(duì)肌纖維類型的影響尚無(wú)相關(guān)研究。本試驗(yàn)以小鼠和C2C12細(xì)胞系為模型，旨在考察FGF21對(duì)肌纖維類型的影響，并探索其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，以期為營(yíng)養(yǎng)手段改善肉品質(zhì)提供調(diào)控靶點(diǎn)和理論依據(jù)。主要研究如下:
　　試驗(yàn)一 禁食對(duì)小鼠骨骼肌FGF21表達(dá)和肌纖維類型的影響

2、r>　　本試驗(yàn)旨在考察禁食對(duì)小鼠骨骼肌FGF21表達(dá)和肌纖維類型的影響。試驗(yàn)選取16只平均體重20g左右的雄性健康C57BL/6小鼠，按體重相近原則隨機(jī)分為2個(gè)組(n=8)，即對(duì)照組和禁食組。小鼠禁食24h后，乙醚麻醉，摘除眼球取血，分離血清待測(cè)。頸椎脫位處死小鼠后，取肝臟、比目魚(yú)肌、腓腸肌和趾長(zhǎng)伸肌待測(cè)。結(jié)果表明:正常小鼠比目魚(yú)肌FGF21 mRNA和蛋白水平顯著高于趾長(zhǎng)伸肌和腓腸肌(P＜0.05)。禁食顯著提高了比目魚(yú)肌和腓腸肌FG

3、F21 mRNA和蛋白表達(dá)(P＜0.05)，但趾長(zhǎng)伸肌FGF21 mRNA和蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化（P＞0.1）。禁食條件下，比目魚(yú)肌和腓腸肌MyHCⅠ mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05）;腓腸肌MyHCⅡa、MyHCⅡx mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05）;趾長(zhǎng)伸肌MyHCⅠ mRNA表達(dá)無(wú)顯著變化(P＞0.1)，但MyHCⅡa、MyHCⅡx mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.05)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，禁食提高了比目魚(yú)肌和腓腸肌FGF21

4、mRNA和蛋白表達(dá)以及氧化型肌纖維的組成，但對(duì)趾長(zhǎng)伸肌中FGF21 mRNA和蛋白表達(dá)以及氧化型肌纖維的組成無(wú)顯著影響。
　　試驗(yàn)二 FGF21處理對(duì)小鼠骨骼肌肌纖維類型的調(diào)控作用
　　本試驗(yàn)旨在考察FGF21處理對(duì)小鼠骨骼肌肌纖維類型的調(diào)控作用。試驗(yàn)選用16只6周齡的健康雄性C57BL/6小鼠，按體重隨機(jī)分為2個(gè)處理，每個(gè)處理8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只小鼠。處理組小鼠按照0.2mg/kg的體重腹腔注射FGF21，連續(xù)注射7d，

5、每天一次，對(duì)照組注射等量生理鹽水。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，摘除眼球取血，分離血清，采集肝臟、比目魚(yú)肌、腓腸肌和趾長(zhǎng)伸肌樣品待測(cè)。結(jié)果表明:小鼠連續(xù)腹腔注射FGF21重組蛋白，血清FGF21水平顯著提高(P＜0.05)，比目魚(yú)肌和趾長(zhǎng)伸肌FGF21 mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，而腓腸肌FGF21 mRNA表達(dá)無(wú)顯著變化（P＞0.1）。FGF21連續(xù)注射7d后，比目魚(yú)肌MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡx mRNA表達(dá)顯著提高(P＜0.05

6、)，而MyHCⅡb mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05);腓腸肌MyHCⅡa mRNA表達(dá)顯著提高（P＜0.05），MyHCⅠ、MyHCⅡx和MyHCⅡb mRNA表達(dá)無(wú)顯著變化(P＞0.1);趾長(zhǎng)伸肌MyHCⅠ和MyHCⅡx mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，MyHCⅡa和MyHCⅡbmRNA表達(dá)無(wú)顯著變化（P＞0.1）。此外，通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21腹腔注射使得比目魚(yú)肌FGF21作用受體FGFR1和FGFR4 mRNA表達(dá)顯著提

7、高(P＜0.05)，KLB mRNA表達(dá)無(wú)顯著變化(P＞0.1)。FGF21連續(xù)處理7d顯著提高了腓腸肌FGFR1 mRNA表達(dá)(P＜0.05)，F(xiàn)GFR4 mRNA表達(dá)有升高的趨勢(shì)（0.05＜P＜0.1），而KLB mRNA表達(dá)有降低的趨勢(shì)（0.05＜P＜0.1）。趾長(zhǎng)伸肌FGFR1 mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，F(xiàn)GFR4 mRNA表達(dá)無(wú)顯著變化，而KLB表達(dá)顯著提高(P＜0.05)。FGF21注射顯著提高了比目魚(yú)肌PGC1

8、α mRNA表達(dá)(P＜0.05)，腓腸肌PGCⅠα表達(dá)無(wú)顯著變化（P＞0.1），而趾長(zhǎng)伸肌PGC1α mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，腹腔注射FGF21改變了肌纖維類型，F(xiàn)GF21可能是通過(guò)與受體結(jié)合調(diào)節(jié)PGC1α表達(dá)實(shí)現(xiàn)此功能的。
　　試驗(yàn)三 FGF21影響小鼠骨骼肌肌纖維類型的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制
　　本試驗(yàn)旨在通過(guò)體外試驗(yàn)研究FGF21影響小鼠骨骼肌肌纖維類型的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。試驗(yàn)采用C2C12細(xì)胞系為研

9、究對(duì)象，待細(xì)胞分化為肌管時(shí)，添加FGF21進(jìn)行處理，收集樣品測(cè)定發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21處理顯著降低了C2C12肌管細(xì)胞FGF21 mRNA表達(dá)(P＜0.05)。通過(guò)免疫熒光研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21顯著提高慢速氧化型肌纖維的組成比例，降低了快速酵解型肌纖維的組成比例（P＜0.05）。熒光定量PCR測(cè)定發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21處理顯著提高了C2C12肌管細(xì)胞MyHCⅠ mRNA表達(dá)(P＜0.05)，而MyHCⅡx mRNA表達(dá)有升高的趨勢(shì)（0.05＜P＜0.

10、1），MyHCⅡa mRNA表達(dá)無(wú)顯著變化（P＞0.1），但MyHCⅡb mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，表明FGF21可以促使肌管中的Ⅱb型肌纖維向Ⅰ型肌纖維轉(zhuǎn)化。AMPK-PGC1α信號(hào)途徑是經(jīng)典的調(diào)節(jié)肌纖維類型轉(zhuǎn)化的信號(hào)途徑，那么AMPK-PGC1α信號(hào)通路是否介導(dǎo)了FGF21對(duì)肌纖維類型轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)作用還不清楚，我們通過(guò)熒光定量PCR測(cè)定了PGC1α mRNA表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在調(diào)節(jié)肌纖維類型轉(zhuǎn)化中具有重要作用的PGC1αmR

11、NA表達(dá)顯著提高（P＜0.05），于是，我們假設(shè)AMPK-PGC1α信號(hào)通路介導(dǎo)了FGF21對(duì)肌纖維類型轉(zhuǎn)化的影響，并進(jìn)行了試驗(yàn)驗(yàn)證。試驗(yàn)首先加入AMPK激活劑Aicar進(jìn)行研究，研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21和Aicar分別單獨(dú)添加顯著提高了MyHCⅠ mRNA表達(dá)(P＜0.05)，顯著降低了MyHCⅡb mRNA表達(dá)(P＜0.05)，Aicar和FGF21同時(shí)加入對(duì)MyHCⅠ和MyHCⅡb mRNA的影響并未呈現(xiàn)出疊加效應(yīng)。而FGF21和Ai

12、car分別單獨(dú)添加顯著提高了PGC1αmRNA表達(dá)(P＜0.05)，二者同時(shí)加入，與FGF21和Aicar分別單獨(dú)加入相比，PGC1αmRNA表達(dá)無(wú)顯著提高。通過(guò)加入AMPK抑制劑，免疫熒光染色統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21提高慢速氧化型肌纖維的組成比例，降低快速酵解型肌纖維的組成比例的效應(yīng)被AMPK抑制劑CC抑制。熒光定量研究表明，F(xiàn)GF21顯著提高了MyHCⅠ mRNA表達(dá)（P＜0.05），CC處理后添加FGF21則降低了MyHCⅠ mR

13、NA表達(dá)(P＜0.05)。Westem blot研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21顯著提高了pAMPK和PGC1α蛋白表達(dá)以及pAMPK/AMPK水平，加入AMPK抑制劑后添加FGF21，F(xiàn)GF21升高pAMPK和PGC1α蛋白表達(dá)以及pAMPK/AMPK水平的效應(yīng)被抑制。說(shuō)明AMPK-PGC1α信號(hào)通路介導(dǎo)了FGF21對(duì)肌纖維類型的調(diào)節(jié)作用。
　　綜上所述，禁食改變了比目魚(yú)肌和腓腸肌的肌纖維組成和FGF21表達(dá)， FGF21可以通過(guò)與細(xì)胞膜上