真核起始因子6(eIF6)在皮膚肌成纖維細(xì)胞分化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:真核起始因子6(Eukaryotic initiation factor6，eIF6)是一種在進(jìn)化過程中的保守蛋白，eIF6通過調(diào)控核糖體40S和60S亞基的結(jié)合在核糖體合成及翻譯調(diào)控中發(fā)揮重要作用。eIF6被認(rèn)為是翻譯起始的限速因子，可影響腫瘤發(fā)生及腫瘤生長(zhǎng)。胞漿中eIF6活性受損可限制淋巴瘤生成及腫瘤進(jìn)展。
　　目的:本研究的目的是探索eIF6是否能影響肌成纖維細(xì)胞的分化？這種作用是否通過調(diào)控TGF-β1的表達(dá)實(shí)現(xiàn)？eI

2、F6又是通過什么分子機(jī)制參與TGF-β1基因的表達(dá)調(diào)控？
　　第一部分 eIF6基因缺陷的雜合子小鼠皮膚肌成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定
　　方法:
　　1.分離新生eIF6+/-雜合子小鼠及野生型小鼠（日齡3天內(nèi)）真皮細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)(eIF6基因完全敲除的eIF6純合子小鼠胚胎在著床前即是致死性的)。本課題實(shí)驗(yàn)中使用的是第1代至第3代的細(xì)胞。
　　2.應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)分離培養(yǎng)的真皮細(xì)胞中Vimentin及α

3、-SMA的表達(dá)。
　　3.應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR法對(duì)分離培養(yǎng)的真皮細(xì)胞進(jìn)行基因型鑒定，區(qū)分來自eIF6+/-雜合子小鼠及野生型小鼠的細(xì)胞。
　　4.應(yīng)用Real-Time PCR及Western blotting技術(shù)檢測(cè)eIF6+/-雜合子及野生型細(xì)胞中eIF6 mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.成功分離培養(yǎng)了新生小鼠真皮肌成纖維細(xì)胞，細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，呈典型的梭型及多角形形態(tài)，細(xì)胞體積較大。
　　2

4、.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示Vimentin及α-SMA在體外培養(yǎng)的新生小鼠真皮胞漿中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞率為100％。
　　3.逆轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳僅顯示320bp一條帶的是來自于野生型小鼠的樣本，而顯示650bp及320bp兩條帶的是來自于eIF6基因表達(dá)缺陷的雜合子小鼠的樣本。
　　4.Western blotting實(shí)驗(yàn)及Real-Time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步確證，與野生型小鼠真皮來源的

5、肌成纖維細(xì)胞相比， eIF6 mRNA的表達(dá)在eIF6+/-雜合子小鼠的真皮肌成纖維細(xì)胞中降低了約40％，eIF6蛋白的表達(dá)在eIF6+/-雜合子小鼠的真皮肌成纖維細(xì)胞中降低了約60％。
　　第二部分 eIF6對(duì)皮膚肌成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性及功能的影響
　　方法:
　　1.采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)體外培養(yǎng)的來源于野生型及eIF6+/-雜合子小鼠真皮肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期。
　　2.采用TUNEL法比較來源于野生型及eI

6、F6+/-雜合子小鼠真皮肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞凋亡的情況。
　　3.應(yīng)用Real-Time PCR及Western blotting技術(shù)檢測(cè)eIF6+/-雜合子及野生型細(xì)胞中α-SMA mRNA及蛋白的表達(dá);應(yīng)用Real-Time PCR技術(shù)檢測(cè)eIF6+/-雜合子及野生型細(xì)胞中Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá);應(yīng)用羅丹明-標(biāo)記鬼筆環(huán)肽染色eIF6+/-雜合子及野生型細(xì)胞中的應(yīng)力纖維并用激光共聚焦顯微鏡觀察應(yīng)力纖維形成的情況;應(yīng)用成纖維細(xì)胞凝膠收

7、縮模型觀察eIF6+/-雜合子及野生型細(xì)胞收縮膠原的能力。
　　結(jié)果:
　　1.采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)體外培養(yǎng)的肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期，結(jié)果顯示:來源于eIF6基因缺陷雜合子小鼠的細(xì)胞處于S期的比例明顯低于來源于野生型小鼠的細(xì)胞(eIF6+/-雜合子細(xì)胞處于S期的比例為6.92％，而野生型細(xì)胞的比例為11.16％)。然而eIF6+/-雜合子細(xì)胞處于G2/M期的比例為42.13％，顯著高于野生型細(xì)胞(僅為27.59％)。

8、　　2.TUNEL法比較來源于野生型及eIF6+/-雜合子小鼠真皮肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞凋亡的情況，兩組間凋亡細(xì)胞與有核細(xì)胞比例的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
　　3.較野生型細(xì)胞相比，α-SMA在eIF6+/-雜合子細(xì)胞中的表達(dá)在mRNA水平及蛋白水平均顯著增高(mRNA表達(dá)增高2.9倍，P=0.020， n=5;蛋白表達(dá)增高1.8倍，P=0.029，n=5)。eIF6+/-雜合子細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型膠原(Col1al and Col1a2) mRNA的

9、量也明顯高于野生型細(xì)胞中的表達(dá)量，Col1al mRNA表達(dá)增高4.9倍(P=0.001，n=3)，Col1a2mRNA表達(dá)增高4.6倍(P=0.007，n=3)。此外，激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示:與野生型細(xì)胞相比，eIF6+/-雜合子細(xì)胞中羅丹明-標(biāo)記鬼筆環(huán)肽染色的應(yīng)力纖維形成增加，排列分布得更加密集。分析膠原收縮能力的成纖維細(xì)胞凝膠收縮模型發(fā)現(xiàn)，eIF6+/-雜合子細(xì)胞收縮膠原的能力強(qiáng)于野生型細(xì)胞(P=0.001，n=3)。
　

10、　第三部分 eIF6對(duì)皮膚肌成纖維細(xì)胞分化過程中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響
　　方法:
　　1.應(yīng)用Real-Time PCR及Western blotting技術(shù)檢測(cè)eIF6+/-雜合子及野生型細(xì)胞中TGF-β1 mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　2.應(yīng)用Real-Time PCR技術(shù)檢測(cè)eIF6+/-雜合子及野生型細(xì)胞中TGF-β1Ⅰ型受體(Tgfbr1)及TGF-β1Ⅱ型受體(Tgfbr2) mRNA的表達(dá);應(yīng)用Western b

11、lotting技術(shù)檢測(cè)在外源性TGF-β1刺激條件下，eIF6+/-雜合子及野生型細(xì)胞中Smad蛋白的表達(dá)。
　　3.應(yīng)用Western blotting技術(shù)檢測(cè)在用SB431542阻斷TGF-β/Smad信號(hào)通路后，eIF6+/-雜合子及野生型細(xì)胞中p-Smad2及α-SMA蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.Real-Time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1(Tgfb1) mRNA在eIF6+/-雜合子細(xì)胞中的表達(dá)

12、顯著高于其在野生型細(xì)胞中的表達(dá)量，Tgfb1 mRNA表達(dá)增高2.7倍(P＜0.001，n=5)。ELISA實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)eIF6+/-雜合子細(xì)胞分泌到培養(yǎng)上清中的TGF-β1也明顯增高（增高1.8倍，P＜0.001，n=5）。
　　2.Real-Time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Tgfbr1及Tgfbr2 mRNA的表達(dá)在eIF6+/-雜合子細(xì)胞及野生型細(xì)胞中無顯著差異(P=NS，n=3)。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:

13、較野生型細(xì)胞相比，eIF6+/-雜合子細(xì)胞中p-Smad2蛋白的表達(dá)增高1.5倍(P=0.008，n=3)，與此同時(shí)抑制性Smad7蛋白的表達(dá)量在eIF6+/-雜合子細(xì)胞中降低50％(P=0.002，n=3)。eIF6+/-雜合子細(xì)胞中p-Smad3蛋白的表達(dá)也增高了，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=NS，n=3）。
　　3.Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SB431542處理可顯著抑制eIF6+/-雜合子細(xì)胞中p-Sm

14、ad2及α-SMA的增高，使其表達(dá)水平與在野生型細(xì)胞中表達(dá)量相當(dāng)。
　　第四部分 eIF6通過影響TGF-β1轉(zhuǎn)錄調(diào)控皮膚肌成纖維細(xì)胞分化的機(jī)制探究
　　方法:
　　1.應(yīng)用多核糖體譜實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)TGF-β1 mRNA在野生型細(xì)胞組與eIF6+/-雜合子細(xì)胞中翻譯效率。
　　2.用放線菌素D(actinomycin D)預(yù)處理細(xì)胞旨在抑制細(xì)胞中新的mRNA的合成，并在處理后不同時(shí)間通過Real-Time PCR的

15、方法檢測(cè)細(xì)胞中原有mRNA隨時(shí)間降解的情況，比較TGF-β1 mRNA在野生型細(xì)胞組與eIF6+/-雜合子細(xì)胞中mRNA穩(wěn)定性差異。
　　3.亞硫酸氫鹽測(cè)序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)檢測(cè)肌成纖維細(xì)胞中TGF-β1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度。
　　4.應(yīng)用定量蛋白組學(xué)iTRAQ技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantitation)篩選野生型

16、及eIF6基因表達(dá)缺陷的肌成纖維細(xì)胞中差異表達(dá)蛋白，并進(jìn)行Westernblotting實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　5.應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)技術(shù)檢測(cè)組蛋白變體H2A.Z和轉(zhuǎn)錄因子Sp1與TGF-β1基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合情況，并用Real-Time PCR方法對(duì)相同處理?xiàng)l件下TGF-β1 mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1.多核糖體譜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在含有質(zhì)量大的多聚核糖體的餾分中TGF-β1 mRNA的含量在野生型細(xì)

17、胞組與eIF6+/-雜合子細(xì)胞組無顯著差異。
　　2.TGF-β1 mRNA在野生型細(xì)胞組與eIF6+/-雜合子細(xì)胞中的半衰期均為10.5h，兩組間TGF-β1 mRNA穩(wěn)定性并無差異。
　　3.BSP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在野生型細(xì)胞組TGF-β1啟動(dòng)子甲基化比例為61.9％，在eIF6+/-雜合子細(xì)胞組TGF-β1啟動(dòng)子甲基化比例為73.8％，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
　　4.iTRAQ實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)302個(gè)與eIF6表達(dá)缺陷相關(guān)的

18、差異表達(dá)蛋白。Go分析發(fā)現(xiàn)，eIF6表達(dá)缺陷導(dǎo)致表達(dá)下調(diào)的差異蛋白與染色體\染色質(zhì)組裝、染色質(zhì)聚集\解聚、DNA包裝、蛋白-DNA復(fù)合物聚集以及核小體聚集密切相關(guān)。其中，eIF6表達(dá)缺陷導(dǎo)致一些組蛋白的表達(dá)顯著降低。在這些差異表達(dá)的組蛋白中，變化程度最大的為Histonevariant H2A.Z（表達(dá)下降50％，P=4.30×10-11＜0.0001）以及Histone H2B（表達(dá)下降約40％，P=1.11×10-5＜0.0001）

19、。我們通過Western blotting實(shí)驗(yàn)對(duì)部分差異表達(dá)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較野生型細(xì)胞相比，組蛋白H2B及組蛋白變體H2A.Z在eIF6+/-雜合子細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低，H2B蛋白表達(dá)降低了45％，H2A.Z蛋白降低了40％(P=0.051，n=3)，該結(jié)果與定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。此外，我還通過Real-Time PCR技術(shù)檢測(cè)了eIF6+/-雜合子細(xì)胞中的H2A.Z(H2afz) mRNA的表達(dá)，H2afz mRNA表達(dá)較

20、野生型細(xì)胞中降低了20％(P=0.015，n=3)
　　5.ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)外源性TGF-β1預(yù)處理的野生型細(xì)胞及eIF6+/-雜合子細(xì)胞，在eIF6+/-雜合子細(xì)胞中H2A.Z與TGF-β1啟動(dòng)子相應(yīng)區(qū)域的結(jié)合較野生型細(xì)胞相比顯著降低，而此時(shí)在野生型細(xì)胞中TGF-β1啟動(dòng)子相應(yīng)區(qū)域有大量的H2A.Z蛋白的結(jié)合(相應(yīng)結(jié)合區(qū)域?yàn)閰^(qū)域1:-120/+73;區(qū)域2:-37/+175;區(qū)域3:-118/+246)。此外，

21、ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示:eIF6+/-雜合子細(xì)胞中Sp1結(jié)合TGF-β1啟動(dòng)子的量顯著高于其在野生型細(xì)胞中的結(jié)合量，并且結(jié)合區(qū)域包含所有Sp1在TGF-β1啟動(dòng)子上的預(yù)期結(jié)合位點(diǎn)。與此同時(shí)，在外源性TGF-β1刺激的條件下TGF-β1誘導(dǎo)自身mRNA表達(dá)量在eIF6+/-雜合子細(xì)胞中顯著增高，是野生型細(xì)胞表達(dá)量的3.4倍(P=0.001，n=5)。
　　結(jié)論:
　　1.eIF6參與調(diào)控肌成纖維細(xì)胞的分化，eIF6表

22、達(dá)缺陷誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞分化，促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA、合成膠原及增強(qiáng)細(xì)胞收縮膠原的能力。
　　2.eIF6負(fù)性調(diào)控肌成纖維細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)，并且該調(diào)控作用主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄層面。
　　3.eIF6表達(dá)缺陷通過下調(diào)組蛋白變體H2A.Z對(duì)TGF-β1啟動(dòng)子的結(jié)合，可能通過增加染色質(zhì)的空間可接近性，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Sp1對(duì)TGF-β1啟動(dòng)子的結(jié)合，導(dǎo)致TGF-β1轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)。
　　4.TGF-β/Smad信號(hào)通路