eIF6在小鼠真皮成纖維細胞機械力信號傳導(dǎo)中的作用及可能機制.pdf

1、背景:增生性瘢痕(HS)是在損傷修復(fù)過程中形成的異常瘢痕，以細胞外基質(zhì)（ECM）過度沉積，以及真皮組織過度增生為特點，是嚴(yán)重?zé)齻蟪Ｒ姷呐R床并發(fā)癥。由于 HS組織中成纖維細胞分泌的基質(zhì)蛋白與正常組織中的基質(zhì)蛋白有所不同，其彈性和強度都大為降低，使組織產(chǎn)生物理和生理功能的明顯缺陷，嚴(yán)重影響創(chuàng)面的修復(fù)質(zhì)量。目前，HS的形成機制仍未完全闡明，但其與機械力作用的密切關(guān)系人所共知。臨床研究表明，HS常發(fā)生在皮膚牽張力較大的部位，伴有極少量的異常細

2、胞；基礎(chǔ)研究也表明，HS的發(fā)生更多是由于機械張力作用引起的細胞功能改變所致；機械力牽拉使創(chuàng)面修復(fù)過程中 ECM的成分和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，產(chǎn)生了更多的膠原沉積和纖維化；細胞對機械力信號的感知及響應(yīng)，是機械力介導(dǎo)的纖維化的基礎(chǔ)。作為傷口愈合的主要修復(fù)細胞之一，真皮成纖維細胞的結(jié)構(gòu)和功能受到機械力負荷的顯著影響。機械力負荷增加，使成纖維細胞的胞膜延展，細胞骨架重排，促進真皮成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，表現(xiàn)為α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達增加

3、，膠原合成增加，收縮力增強，但具體的調(diào)節(jié)機制尚未完全闡明。
　　轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）是肌成纖維細胞功能活化的重要分子，能促進創(chuàng)面新生肉芽組織的膠原過度沉積及纖維化，與瘢痕增生的關(guān)系最為密切。有研究表明，TGF-β1受到機械力信號的調(diào)節(jié)：在穩(wěn)態(tài)下，TGF-β與包括非活性相關(guān)肽（LAPs）、TGF-β結(jié)合蛋白（LTBPs）在內(nèi)的大前體復(fù)合物（LLC）一起受限于ECM中。當(dāng)組織發(fā)生損傷后，由于TGF-β可與整合素結(jié)合，顯著增

4、加的機械力可通過整合素的信號傳導(dǎo)，使TGF-β從LLC上釋放；后者與TGF-β的I型和II型受體結(jié)合，繼而活化 Smad蛋白，促進增生性瘢痕的生長。體外研究證實，周期性機械力牽拉可使TGF-β1的水平顯著增加，提高下游磷酸化Smad2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。這些研究提示，TGF-β1在機械力引起的增生性瘢痕形成中可能起重要作用，但是其在機械力作用下的具體調(diào)節(jié)機制尚不明確，尋找機械力作用下 TGF-β1的抑制因子，可能有助于控制機械力作用下增生性瘢痕

5、的生長。
　　近年研究發(fā)現(xiàn)，真核起始因子6（eIF6）1可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)TGF-β1的表達；皮膚損傷后，eIF6敲降小鼠的TGF-β1表達較野生型小鼠顯著升高，α-SMA陽性的肌成纖維細胞也顯著增加，因此eIF6參與調(diào)控肌成纖維細胞的分化，影響膠原合成及增生性瘢痕的形成。但在機械力負荷增加、TGF-β1表達上調(diào)的情況下，eIF6是否能響應(yīng)機械力的變化，并在TGF-β1調(diào)節(jié)中繼續(xù)發(fā)揮重要作用，從而影響成纖維細胞的穩(wěn)態(tài)及修復(fù)組織的纖維

6、化程度，尚沒有相關(guān)的研究報道。
　　研究內(nèi)容及方法:本課題利用體內(nèi)、體外機械力牽拉模型，觀察eIF6及TGFβ/Smad通路在機械力介導(dǎo)的相關(guān)變化及在纖維化中可能的調(diào)節(jié)作用。
　　體內(nèi)研究部分：利用原創(chuàng)的小鼠部分真皮損傷建模工具，在野生型（WT，eIF6+/+）小鼠及eIF6敲降（eIF6+/-）小鼠背部建立部分真皮損傷創(chuàng)面模型；并利用皮膚缺損張力縫合技術(shù)及無張力縫合技術(shù)，控制小鼠背部的部分真皮損傷創(chuàng)面模型的牽張力水平，從而

7、將小鼠分為“假手術(shù)對照組”和“張力增加組”（根據(jù)需要對兩組設(shè)置“單純牽拉組”、“LY21097612處理組”及“DMSO3對照組”三個亞組）；在制創(chuàng)后3d、5d、7d、14d和21d，觀察各組小鼠部分真皮損傷創(chuàng)面的愈合情況；取部分真皮損傷創(chuàng)面及創(chuàng)周1mm范圍內(nèi)的皮膚組織，進行石蠟包埋切片及肉芽組織的總蛋白提??；利用HE染色、Masson染色、免疫組化染色、免疫熒光染色及Western Blotting等技術(shù)，觀察創(chuàng)面新生肉芽組織的面積、

8、膠原沉積情況，以及eIF6、增殖細胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen， PCNA）等蛋白表達的變化。
　　體外研究部分：原代培養(yǎng)野生型（WT，eIF6+/+）及eIF6敲降（eIF6+/-）新生小鼠真皮成纖維細胞，將第2~3代細胞轉(zhuǎn)至Bioflex?六孔板上，分別設(shè)置“未牽拉對照組”及“機械力牽拉組”（根據(jù)需要對兩組設(shè)置“單純牽拉組”、“LY2109761處理組”及“DMSO對照組”三個

9、亞組），對細胞進行0.1Hz、10％形變的循環(huán)機械力牽拉刺激，牽拉時間設(shè)置為4h、8h、16h和24h。利用免疫組化、免疫熒光、Western Blotting等技術(shù)，觀察小鼠真皮成纖維細胞eIF6、TGF-β1、COL1A1、PCNA、α-SMA、TGF-β/Smad 通路相關(guān)蛋白的表達變化，利用qRT-PCR技術(shù)檢測eIF6、TGF-β1、PCNA及COL1A1 mRNA的表達變化。
　　結(jié)果:本實驗利用原創(chuàng)的小鼠部

10、分真皮損傷建模工具，結(jié)合缺損皮膚張力風(fēng)和技術(shù)，成功建立了小鼠部分真皮損傷機械力牽拉動物模型。體內(nèi)、體外研究顯示，機械力牽拉顯著增加COL1A1、TGF-β1及eIF6的表達，促進小鼠創(chuàng)面新生組織中真皮成纖維細胞的增殖。體外研究表明，eIF6敲降使機械力牽拉作用下小鼠真皮成纖維細胞COL1A1的表達較野生型顯著增加，并促進TGF-β/Smad信號進一步活化；利用LY2109761抑制TGF?βI/II型受體，能顯著降低eIF6+/-小鼠真

11、皮成纖維細胞的COL1A1表達；體內(nèi)研究也表明，eIF6敲降使機械力牽拉作用下小鼠部分真皮損傷創(chuàng)面新生組織較野生型顯著增加。利用LY2109761抑制TGF-βI/II型受體，能顯著降低eIF6+/-小鼠部分真皮損傷創(chuàng)面新生組織體積。
　　全文結(jié)論:機械力牽拉促進小鼠部分真皮損傷創(chuàng)面真皮成纖維細胞的增殖，并顯著增加COL1A1和TGF-β1的表達，同時也使eIF6表達水平顯著增加；eIF6敲降顯著增加機械力牽拉作用下小鼠部分真皮損