nanog和CD73在心成纖維細(xì)胞向心肌分化中的作用機(jī)制.pdf

1、成纖維細(xì)胞分布廣泛，對(duì)機(jī)體組織結(jié)構(gòu)和功能的維持十分重要。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，成纖維細(xì)胞是一種均一的細(xì)胞群，在不同的器官組織中，發(fā)揮其支持和分泌功能。近期研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞是多種成纖維細(xì)胞亞群的總稱，在細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)增殖、膠原合成、分泌細(xì)胞因子和表面受體表達(dá)等方面具有顯著異質(zhì)性。由于近年來發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞樣特性，表現(xiàn)出多向分化的潛能，故已成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。但不同器官的成纖維細(xì)胞是否存在分子標(biāo)記的表達(dá)差異，以及它們?cè)诜只瘽?/p>

2、能方面是否存在異質(zhì)性等，目前尚缺少比較性研究。心肌細(xì)胞的增殖能力較低，一旦心肌細(xì)胞受到損傷，低效率的心肌細(xì)胞增殖很難滿足心肌修復(fù)的需要。而心臟成纖維細(xì)胞數(shù)量巨大，占心臟細(xì)胞總數(shù)高達(dá)60％，抗缺氧損傷能力強(qiáng)，具有較高的增殖和代謝活性。如果能將具有增殖和分化潛能的心肌成纖維轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞，不但可以減少對(duì)心臟的不利影響，而且可高效增加心肌細(xì)胞數(shù)量，改善心功能。但如下問題需要闡明：心肌成纖維細(xì)胞是否表達(dá)多種干細(xì)胞的標(biāo)記物，具備干細(xì)胞的生物特性；

3、不同心肌成纖維細(xì)胞亞群的心肌分化差異如何？是否存在心肌分化優(yōu)勢(shì)亞群；心肌化優(yōu)勢(shì)亞群在體外培養(yǎng)和體內(nèi)損傷心肌修復(fù)中的療效評(píng)價(jià)如何；成纖維細(xì)胞在心肌分化中關(guān)鍵基因及其相互調(diào)控的分子機(jī)制如何？本研究評(píng)價(jià)新生大鼠心、肺、脾、腎、肝和皮膚的成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)、表面標(biāo)記、多向分化潛能等方面差異；探討心臟成纖維細(xì)胞（CFs）心肌化不同時(shí)段nanog、sox2和c-Myc等相關(guān)基因表達(dá)的時(shí)程順序；分選出CFs不同亞群，比較不同亞群向心肌分化差異，抑

4、制、敲除或過表達(dá)心肌分化及干細(xì)胞相關(guān)基因CD73和nanog，檢測(cè)sca-1、c-kit、sox2和c-myc的表達(dá)差異，證實(shí)CD73和nanog是CFs向心肌分化的關(guān)鍵基因及其相互作用，并驗(yàn)證CFs不同亞群及關(guān)鍵基因在心肌梗死動(dòng)物模型中的生物學(xué)行為及其對(duì)心肌損傷的治療作用。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、挪煌鞴俪衫w維細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)和鑒定存在異質(zhì)性。為了證明不同器官成纖維細(xì)胞的生物學(xué)表型差別，篩選出心肌分化的優(yōu)勢(shì)細(xì)胞群，利用酶聯(lián)

5、合消化法對(duì)心、肝、脾、肺、腎和皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外分離培養(yǎng)和比較。此方法分離培養(yǎng)的細(xì)胞活力好、純度高、收獲細(xì)胞量大。但不同器官成纖維細(xì)胞存在明顯的異質(zhì)性，主要表現(xiàn)為：酶消化時(shí)間不同。心、肺、肝、脾、腎和皮膚組織塊（1mm3）的酶作用時(shí)間分別為40 min、30 min、25 min、20 min、35 min和80 min；細(xì)胞形態(tài)有差別。多器官成纖維細(xì)胞在細(xì)胞形狀和胞體大小上略有差別；生長(zhǎng)速率不同。依據(jù)測(cè)定的生長(zhǎng)曲線，肺成纖維細(xì)胞增

6、殖速率最快，依次是皮膚、肝、腎、脾和心成纖維細(xì)胞。常見成纖維細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)不同。DDR2在肺和腎的成纖維細(xì)胞中不表達(dá)，皮、肝和脾中僅有部分成纖維細(xì)胞表達(dá)，在心成纖維細(xì)胞中呈強(qiáng)表達(dá)，因此，DDR2可作為心成纖維細(xì)胞的有效標(biāo)記蛋白。而vimentin和FSP1聯(lián)合鑒定可作為皮、肝、腎、脾和肺成纖維細(xì)胞有效分子標(biāo)記。
　?、撇煌鞴俪衫w維細(xì)胞存在間充質(zhì)干細(xì)胞表型的異質(zhì)性。細(xì)胞水平和組織水平分別檢測(cè)不同器官成纖維細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記差異，并鑒

7、定其在成脂、成骨、成神經(jīng)和成心肌定向分化潛能方面存在的差異。組織水平上心、皮膚和肝成纖維細(xì)胞表達(dá)nanog較高，肝、腎和皮成纖維細(xì)胞表達(dá)c-kit較多，而肝、皮和脾中sca-1+成纖維細(xì)胞含量較多；細(xì)胞水平上顯示，六種器官中部分成纖維細(xì)胞表達(dá)nanog、c-kit和sca-1，但陽性率高于組織水平；CD90流式分選六種器官成纖維細(xì)胞陽性率顯示，皮成纖維細(xì)胞為76.5%，心為34.9%，肺為13.8%，腎為6.8%，肝為0.8%，脾僅為0

8、.2%；體外多向分化誘導(dǎo)顯示，皮膚成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的多向誘導(dǎo)分化潛能，心成纖維細(xì)胞次之，肝和腎成纖維細(xì)胞在向心肌分化中也具有優(yōu)勢(shì)，脾成纖維細(xì)胞在成骨方面具有優(yōu)勢(shì)外，其余均最低。提示心成纖維細(xì)胞在向心肌分化中并非是最優(yōu)器官。
　?、荂Fs干細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)的生物表型多樣性。細(xì)胞免疫熒光三標(biāo)技術(shù)檢測(cè)部分CFs中nanog分別和CD73、CD90和sca-1，及其CD90和sca-1存在共表達(dá)，且nanog+/CD73+共表達(dá)陽性率最高

9、（59.02+8.39%），與其它三組相比均有極顯著差異（P<0.01）；而 nanog+/CD90+共表達(dá)CFs陽性率與nanog+/sca-1+之間沒有顯著差異（P>0.05），但這兩組與CD90+/sca-1+相比均有極顯著差異（P<0.01）；CD90+/sca-1+共表達(dá)CFs陽性率均低于其它三組，差異具有極顯著意義（P<0.01）。說明CFs存在干細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)亞群，在表型上存在多樣性。
　?、菴Fs心肌化誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)各

10、相關(guān)基因表達(dá)差異。5-aza誘導(dǎo)CFs后5d、7d、14d、21d和28d，細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)速率不同；nanog和sox2伴隨著心肌化進(jìn)程呈現(xiàn)表達(dá)下降趨勢(shì)，而CD73、cMyc、klf4、Mef2c和cTnT則呈現(xiàn)出表達(dá)逐步增加，CD90在五個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)變化不大，但整體表達(dá)水平較高，而c-kit在14d時(shí)略微下降，整體表達(dá)水平較低。cTnT表達(dá)在心肌化誘導(dǎo)28d最為穩(wěn)定，5d少量細(xì)胞表達(dá)，7d～14d cTnT陽性細(xì)胞數(shù)明顯增高，28d表達(dá)

11、趨于穩(wěn)定，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)至35d和至40d，cTnT陽性細(xì)胞數(shù)量未見明顯改變。④CFs心肌化誘導(dǎo)28d亞微結(jié)構(gòu)觀察顯示，細(xì)胞與細(xì)胞間出現(xiàn)端-端連接，但特化連接不典型。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量的肌原纖維，排列較為規(guī)律，但肌節(jié)不明顯，H帶、Z線和M線顯示不清。
　?、蒀D90+CFs為心肌樣細(xì)胞分化優(yōu)勢(shì)亞群。使用PE-標(biāo)記CD90、PE-標(biāo)記陰性對(duì)照，不加抗體的為空白對(duì)照。流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選CFs，其陽性比率為34.9%。體外擴(kuò)大培養(yǎng)后，細(xì)胞免

12、疫熒光檢測(cè)其表型穩(wěn)定；心肌化誘導(dǎo)CD90+亞群，28d時(shí)，cTnT陽性細(xì)胞比率為61.17+9.75%，混合群cTnT陽性細(xì)胞比率為53.44+16.80%，表明CD90+細(xì)胞群體外培養(yǎng)條件下更有利于向心肌細(xì)胞分化；DAPI標(biāo)記CD90+CFs細(xì)胞核，移植入急性心肌梗死動(dòng)物模型梗死區(qū)和梗死邊緣區(qū)，追蹤移植細(xì)胞在模型動(dòng)物體內(nèi)的存活及其向心肌樣細(xì)胞的分化能力。超聲心動(dòng)檢測(cè)，在CD90+CFs移植組中，與細(xì)胞移植前相比，移植后1周和2周左室射

13、血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，移植后2周較移植后1周也顯著提高，差異具有極顯著意義(LVEF：61.40+2.45%vs56.25+2.93%，LVFS：33.21+0.68%vs30.26+2.06%，P<0.01)。與CFs移植組相比，CD90+CFs移植組在移植后1周和2周，LVEF有所升高，LVFS略微下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LVEF：61.40+2.45%vs60.

14、10+1.25%，LVFS：33.21+0.68%vs33.85+2.00%，P>0.05）。病理組織切片證實(shí)在體內(nèi)微環(huán)境作用下，僅有少部分CD90+CFs向心肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化和參與新生血管的生成。
　　⑹慢病毒分組轉(zhuǎn)染目的基因，確定心肌分化關(guān)鍵基因，探討關(guān)鍵基因之間的調(diào)控機(jī)制。為探討決定心肌分化的關(guān)鍵基因，構(gòu)建nanog抑制、CD73抑制和過表達(dá)慢病毒載體，分別或共轉(zhuǎn)染CFs，實(shí)驗(yàn)分組為nanog抑制表達(dá)轉(zhuǎn)染組、CD73抑制表達(dá)轉(zhuǎn)染

15、組、CD73過表達(dá)轉(zhuǎn)染組、nanog抑制和CD73抑制共轉(zhuǎn)染組、nanog抑制和CD73過表達(dá)共轉(zhuǎn)染組，同時(shí)設(shè)立空載體轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照。采用滴度稀釋法，確定各實(shí)驗(yàn)組MOI。nanog抑制表達(dá)轉(zhuǎn)染組MOI值為40，CD73抑制表達(dá)轉(zhuǎn)染組為50，CD73過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染組為40。nanog顯著影響細(xì)胞增殖，CD73對(duì)其影響不大。各組慢病毒轉(zhuǎn)染陽性率>85%，視為轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染后180 hrs觀察各組轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞增殖速率。發(fā)現(xiàn)nanog抑制的

16、陽性細(xì)胞增殖緩慢，由轉(zhuǎn)染時(shí)陽性率為92%降低至35%；但在CD73抑制組和CD73過表達(dá)組中，陽性細(xì)胞的增殖則不受影響，陽性率仍然達(dá)到85%以上；在共轉(zhuǎn)染組中，nanog抑制的陽性細(xì)胞較CD73過表達(dá)或抑制的生長(zhǎng)速率稍慢，但共轉(zhuǎn)染陽性率較為穩(wěn)定。nanog抑制或者CD73過表達(dá)，或兩者的協(xié)同作用，更有利于CFs向心肌樣細(xì)胞分化。nanog抑制和CD73過表達(dá)共轉(zhuǎn)染組呈現(xiàn)出較強(qiáng)的心肌細(xì)胞分化優(yōu)勢(shì)，cTnT和cMyc基因表達(dá)水平較高，而na

17、nog和sox2表達(dá)下降；其次是CD73過表達(dá)轉(zhuǎn)染組，呈現(xiàn)出CD73基因的過表達(dá)，表現(xiàn)為cTnT的高表達(dá)；CD73抑制后，cTnT表達(dá)下降，而nanog、sox2表達(dá)反而上升。RTCA Cardio ECR系統(tǒng)實(shí)時(shí)檢測(cè)心肌化誘導(dǎo)各慢病毒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線不同，未檢測(cè)到其律動(dòng)與場(chǎng)電位。心肌化的CD73過表達(dá)組、未誘導(dǎo)的nanog抑制和CD73過表達(dá)共轉(zhuǎn)染組、未誘導(dǎo)的nanog抑制和CD73抑制共轉(zhuǎn)染組和未誘導(dǎo)的nanog抑制組細(xì)胞增殖能力

18、較強(qiáng)；心肌化的nanog抑制組、心肌化的nanog抑制和CD73過表達(dá)共轉(zhuǎn)染組和心肌化的未轉(zhuǎn)染組其次；而心肌化的nanog抑制和CD73抑制共轉(zhuǎn)染組增殖能力最弱。但在不同時(shí)間點(diǎn)均未檢測(cè)到不同處理的各個(gè)慢病毒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的跳動(dòng)和胞外電活動(dòng)。
　?、搜芯勘砻鳎翰煌鞴俪衫w維細(xì)胞在生長(zhǎng)方式、形態(tài)特點(diǎn)、間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)等存在明顯的異質(zhì)性，但CFs并非心肌分化最優(yōu)種子細(xì)胞；CFs是由不同亞群組成的、具有干細(xì)胞特征混合細(xì)胞群，根據(jù)其干細(xì)胞標(biāo)