柯薩奇病毒感染小鼠心肌細(xì)胞及心臟成纖維細(xì)胞后CD80與CD86的表達(dá)情況.pdf

1、目的：病毒性心肌炎（Viral myocarditis，VMC）是指由病毒感染引起的心肌疾病，其中最常見(jiàn)的原因是由柯薩奇病毒B3( Coxsackie virus B3， CVB3)感染。病毒感染以后引起心肌炎的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前較多的研究認(rèn)為是病毒直接損傷和感染后機(jī)體的免疫反應(yīng)引發(fā)的炎癥性損傷。病毒性心肌炎可發(fā)展為擴(kuò)張性心肌病，兒童發(fā)病后致死致殘率較高，且到目前為止臨床仍然缺乏特效的治療方法。因此對(duì)于CVB3感染以后引起病毒性

2、心肌炎的發(fā)病過(guò)程以及治療方法的研究都非常有必要。心臟中除了最有功能的心肌細(xì)胞以外，還有50％的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。所以對(duì)心臟心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在CVB3刺激以后產(chǎn)生的反應(yīng)進(jìn)行研究，可以為研究病毒性心肌炎的發(fā)病過(guò)程及找到有效的治療方法提供一定的依據(jù)。
　　方法：
　　1體外培養(yǎng)C57BL/6小鼠心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞：無(wú)菌操作取新生C57BL/6小鼠心臟，取出后，放入不含有血清和抗生素的DMEM高糖培養(yǎng)基中。先除心臟以外的組

3、織，再使用吸管反復(fù)吹打進(jìn)行沖洗，沖洗完的心臟中重新加入少量不含血清和雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基。用無(wú)菌剪刀將其剪碎，依次用胰酶與Ⅱ型膠原酶消化后，用銅網(wǎng)過(guò)濾。將濾液收集到離心管中進(jìn)行離心。去掉上清液后再離心一次，再次棄去上清液，加入含有血清和雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基。吹散后將細(xì)胞鋪入六孔板內(nèi)。90分鐘后，把孔內(nèi)未貼壁的細(xì)胞吸出移至新的六孔板中，向剩余孔內(nèi)再加入新鮮的含血清DMEM高糖培養(yǎng)基（采用1.5小時(shí)差速貼壁法分離培養(yǎng)小鼠心肌細(xì)胞與心

4、臟成纖維細(xì)胞）。最后將六孔板放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃進(jìn)行培養(yǎng)。
　　2培養(yǎng)經(jīng)柯薩奇病毒感染后的小鼠心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞并且觀察細(xì)胞病變。
　　3細(xì)胞CD80和CD86的表達(dá)情況測(cè)定：Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按照試劑說(shuō)明提取感染柯薩奇病毒后不同時(shí)間點(diǎn)的心肌細(xì)胞總RNA和心臟成纖維細(xì)胞總RNA。本實(shí)驗(yàn)中心肌細(xì)胞感染柯薩奇病毒后選擇的時(shí)間點(diǎn)分別為1天、3天、5天、7天、9天；心臟成纖維細(xì)胞感染柯薩奇病毒后選擇的時(shí)間點(diǎn)分

5、別為3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)。未感染病毒的正常細(xì)胞作為對(duì)照組，進(jìn)行Real Time PCR擴(kuò)增，觀察細(xì)胞CD80和CD86的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1小鼠心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞能夠進(jìn)行體外培養(yǎng)并且生長(zhǎng)狀況良好。
　　2觀察柯薩奇病毒感染后的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)：小鼠心肌細(xì)胞中部分細(xì)胞出現(xiàn)了病變，而小鼠心臟成纖維細(xì)胞中只有少量細(xì)胞出現(xiàn)了病變。
　　3進(jìn)行Real Time PCR后，結(jié)果顯

6、示:感染柯薩奇病毒以后，心肌細(xì)胞中CD80的mRNA的表達(dá)在第1天驟然下降，而后開(kāi)始升高，在第3天達(dá)到高峰，接著又開(kāi)始下降，第5天、第7天、第9天持續(xù)下降，整個(gè)過(guò)程均在正常水平以下；CD86的mRNA的表達(dá)同樣在第1天明顯下降，而后開(kāi)始升高，在第3天達(dá)到高峰，接著開(kāi)始下降，第5天、第7天、第9天持續(xù)下降，整個(gè)過(guò)程均在正常水平以下。Real Time PCR的結(jié)果也顯示，在被柯薩奇病毒感染以后，心臟成纖維細(xì)胞中CD80的mRNA的表達(dá)在3

7、小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)持續(xù)下降，24小時(shí)降至最低點(diǎn)，接著開(kāi)始上升，48小時(shí)、72小時(shí)持續(xù)上升，整個(gè)過(guò)程均在正常水平以下；CD86的mRNA的表達(dá)在3小時(shí)、6小時(shí)持續(xù)下降，6小時(shí)降至最低點(diǎn)，但在12小時(shí)突然升高，超過(guò)正常水平，達(dá)到最高峰，接著24小時(shí)又下降，但在48小時(shí)又升高，達(dá)到第二個(gè)高峰，第二個(gè)高峰在正常水平以下，在72小時(shí)又下降。結(jié)果表明CD80和CD86的低表達(dá)可能是造成成年人早期感染CVB3以后，免疫損傷較輕而病毒直接

8、損傷較重的原因。
　　結(jié)論：
　　1 CVB3感染以后，早期病毒主要對(duì)部分小鼠的心肌細(xì)胞進(jìn)行破壞，而并未明顯損傷心臟成纖維細(xì)胞，小鼠心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)均有增殖。
　　2正常小鼠的心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞中均表達(dá)CD80與CD86mRNA。
　　3在小鼠心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞被CVB3感染以后，細(xì)胞內(nèi)的CD80與CD86mRNA的表達(dá)均會(huì)出現(xiàn)波動(dòng)性的變化，且均有明顯的表達(dá)降低。由此我們可以認(rèn)為感