宿主細胞F-actin聚集與雞球蟲入侵關系研究.pdf

1、雞球蟲病是由多種艾美耳球蟲寄生于雞的腸上皮細胞內所引起的一種寄生性原蟲病。雞球蟲種類不同，寄生部位和致病性亦有差異，其中柔嫩艾美耳球蟲是致病性最強、危害最為嚴重的一種。近年來隱孢子蟲、弓形蟲和瘧原蟲在入侵機制的研究方面發(fā)展迅速，研究發(fā)現(xiàn)蟲體入侵會引起宿主細胞骨架結構的變化。而雞球蟲也是頂復門原蟲，其入侵機制是否相似？為了探討這一問題，本試驗以HCT-8傳代細胞建立體外培養(yǎng)模型，對雞球蟲入侵該細胞的規(guī)律、球蟲接種劑量、培養(yǎng)基類型、血清濃度

2、、pH等培養(yǎng)條件進行優(yōu)化；在此基礎上，探索了宿主細胞骨架結構改變對柔嫩艾美耳球蟲子孢子入侵的影響。
　　1.柔嫩艾美耳球蟲HCT-8細胞培養(yǎng)模型的建立。通過在24孔細胞板上接種一定數(shù)量子孢子后不同時間取樣，采用HE染色后在顯微鏡下觀察球蟲入侵該細胞后的發(fā)育情況。結果顯示球蟲子孢子入侵HCT-8細胞后可以發(fā)育到第2代裂殖子階段，表明建立的模型可以用于球蟲入侵階段的研究。
　　2.柔嫩艾美耳球蟲對HCT-8細胞入侵條件的優(yōu)化。以

3、Real-time RT PCR方法評價子孢子最佳入侵時間、最適接種劑量、培養(yǎng)基種類、pH值及血清濃度對雞球蟲子孢子入侵率的影響。結果顯示，雞球蟲在體外培養(yǎng)條件下，最佳入侵時間為6h，子孢子接種劑量為3×105個/孔時入侵達到飽和，當培養(yǎng)基為RPMI1640且pH值為6.5時子孢子入侵率最高，血清濃度為1％時最有利于子孢子入侵。試驗優(yōu)化了雞球蟲入侵HCT-8細胞的條件，為雞球蟲入侵機制的研究奠定了基礎。
　　3.雞球蟲入侵與宿主細

4、胞骨架結構的關系。先將一定數(shù)量的柔嫩艾美耳球蟲子孢子接種到HCT-8細胞，入侵一定時間后取樣，對樣品細胞內F-actin(肌動蛋白)進行亞細胞定位。用不同濃度的細胞松弛素D抑制宿主細胞F-actin聚集，免疫熒光染色同時以Real-time RT PCR方法評價子孢子對HCT-8細胞的入侵率。結果顯示球蟲入侵宿主細胞過程中，宿主細胞F-actin特異性聚集在球蟲子孢子表面。球蟲入侵率隨著該藥物濃度增加而下降，當濃度達到50μg/mL時入