微小隱孢子蟲重組BCG-CP15-60-23疫苗的構(gòu)建及其保護性研究.pdf

1、隱孢子蟲(Cryptosporidium)是Tyzzer于1907年首先在實驗小鼠胃腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，它是一種屬于頂端復(fù)合物門的寄生性原蟲。隱孢子蟲有很多種類，其有效蟲種有10余種，對人和大多數(shù)脊椎動物造成感染的主要是Tyzzer于1912年發(fā)現(xiàn)的另一種蟲種--微小隱孢子蟲(C.parvum)。隱孢子蟲感染引起的隱孢子蟲病(Cryptosporidiosis)是一種全球性的人畜共患寄生蟲病。正常人感染隱孢子蟲后，雖可引起急性腹瀉，但常為自限

2、性：免疫力低下、功能缺陷或免疫抑制的患者(如嬰幼兒、艾滋病患者、營養(yǎng)不良者、器官移植后、腫瘤患者等)感染此蟲后，則可引起嚴(yán)重胃腸炎并伴有水樣腹瀉，導(dǎo)致大量體液丟失而危及生命，該病已被確定為引起人腹瀉的六大病因之一。在艾滋病(AIDS)患者中感染率高達48％左右，長期的嚴(yán)重腹瀉，是艾滋病病人的重要致死因素之一。該蟲致病力較強，小劑量(50％感染劑量ID50為132個卵囊)的微小隱孢子蟲卵囊足以引起健康自愿受試者感染。由于隱孢子蟲卵囊體積微

3、小(直徑4-6μm)、分布廣泛，常規(guī)氯化飲水消毒方法不能將其殺滅，故對人類公共衛(wèi)生造成很大威脅。國外暴發(fā)流行時有報告，多發(fā)生于病人或病牛接觸后的人群，或幼兒園和托兒所等集體單位。發(fā)生在美國威斯康星州(Wisconsin)密爾沃基(Milvaukee)的那次暴發(fā)中，據(jù)估計超過40余萬居民染上了水樣腹瀉，致死100多人，危害非常大。因此，隱孢子蟲病成為目前各國重點研究的寄生蟲病之一。我國自1987年南京報道首例隱孢子蟲病以來，江蘇、浙江、安

4、徽、福建、內(nèi)蒙古、云南、四川、山東及上海等省市均已證實有該病存在，其感染率為1.4％-13.3％不等。自從發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲以來，許多研究者一直致力于該病的防治研究，但迄今為止，對該病尚無有效的防治措施，因此對該病的早期診斷、治療以及研究防治該病的疫苗就顯得尤為重要。 卡介苗是用來預(yù)防結(jié)核病的牛型結(jié)核分枝桿菌減毒活疫苗，以卡介苗為載體的基因重組卡介苗因其具有集疫苗與佐劑于一體的特點，在免疫功能的研究、傳染病和腫瘤的防治中均發(fā)揮了重要作

5、用，成為近年來研究的熱點。 本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)，將編碼表面抗原CP23和CP15/60的基因構(gòu)建在同一穿梭質(zhì)粒表達載體上，轉(zhuǎn)化BCG，高效表達CP15/60-23融合蛋白，對重組蛋白進行純化和鑒定；并用重組BCG直接免疫小鼠，觀察到它能刺激機體產(chǎn)生特異性抗體和細胞因子，具有較強的免疫原性，為重組BCG-CP15/60-23疫苗的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 本研究的主要方法、結(jié)果及結(jié)論: 1.微小隱孢子蟲動物模型的建立

6、及其卵囊的分離純化 方法：在飲水中加入地塞米松磷酸鈉注射液(15μg/ml)抑制BALB/c小鼠免疫功能，灌胃接種微小隱孢子蟲卵囊(1×105個/只)使小鼠感染，收集小鼠糞便，用改良抗酸染色法確定感染成功，用不連續(xù)蔗糖密度梯度離心法純化微小隱孢子蟲卵囊。用PBS稀釋純化的卵囊，加入DMSO，置于-40℃3h后，放入液氮中保存。 結(jié)果：成功建立了微小隱孢子蟲感染的BALB/c小鼠動物模型，所有實驗小鼠均感染，從接種3天起向

7、體外排出卵囊；改良抗酸染色法藍綠色背景下玫瑰紅色的卵囊清晰可見；不連續(xù)蔗糖密度梯度離心法獲得了大量純度較高且有活力的卵囊，適合于免疫學(xué)和分子生物學(xué)使用。 結(jié)論：微小隱孢子蟲感染動物模型的成功建立及高純度卵囊的獲得，為隱孢子蟲的傳代及后續(xù)的分子生物學(xué)和免疫學(xué)的研究打下了基礎(chǔ)。 2.微小隱孢子蟲表面抗原CP23基因、CP15/60-23復(fù)合基因載體的構(gòu)建及鑒定 方法：將純化的微小隱孢子蟲卵囊(約1×108個)加入裂解

8、液后在液氮中反復(fù)凍融3次，用酚-氯仿抽提法提取微小隱孢子蟲卵囊的基因組DNA。根據(jù)GenBank報道的CP23基因和CP15/60基因序列的開放讀碼框架分別設(shè)計合成引物；PCR法擴增CP23、CP15/60基因片段，切膠純化回收后，分別將二者克隆至TA克隆載體pMD18-TSimpleVector；通過酶切、測序鑒定正確后，將CP23基因片段亞克隆至pET-30a(+)載體，構(gòu)建成pET-30a-23質(zhì)粒：再將CP15/60基因片段克隆

9、至pET-30a-23質(zhì)粒，構(gòu)建成pET-30a-15/60-23質(zhì)粒，然后將二者分別轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α。 結(jié)果：提取微小隱孢子蟲基因組DNA，PCR擴增出預(yù)期的CP23片段(342bp)和CP15/60片段(444bp)；成功構(gòu)建了pMD18-T-23和pMD18-T-15/60質(zhì)粒，以及重組表達質(zhì)粒pET-30a-23和pET-30a-15/60-23。測序結(jié)果表明：與GenBank報道的基因序列相比，CP23基因有8個

10、堿基不同，導(dǎo)致3個編碼氨基酸發(fā)生改變，并且比原序列多出了6個堿基；CP15/60基因有6個堿基不同，導(dǎo)致1個編碼氨基酸發(fā)生改變，但都沒有改變原序列的開放閱讀框架。 結(jié)論：成功構(gòu)建了pET-30a-23和pET-30a-15/60-23重組表達質(zhì)粒。 3.微小隱孢子蟲重組BCG-CP15/60-23疫苗的構(gòu)建及鑒定 方法：以pET-30a-15/60-23質(zhì)粒為模板，PCR擴增CP15/60-23基因片段，并克隆至

11、TA克隆載體pMD18-TSimpleVector。通過酶切、測序鑒定正確后，將CP15/60-23基因片段亞克隆至PMV-262穿梭質(zhì)粒載體，構(gòu)建成PMV-262-CP15/60-23重組質(zhì)粒，用電穿孔法將其轉(zhuǎn)化至BCG中。熱誘導(dǎo)使其表達，表達蛋白用SDS-PAGE初步分析；經(jīng)過純化、復(fù)性后的重組抗原用Westernblot分析鑒定。 結(jié)果：PCR擴增出預(yù)期的CP15/60-23片段(786bp)，成功構(gòu)建了pMD18-T-C

12、P15/60-23以及重組表達質(zhì)粒PMV-262-CP15/60-23。經(jīng)熱誘導(dǎo)后表達出了約46kDa的融合蛋白，純化后的重組蛋白經(jīng)Westernblot分析鑒定證實能被兔抗隱孢子蟲多克隆抗體識別。 結(jié)論：成功構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒PMV-262-CP15/60-23，并成功將其轉(zhuǎn)化至BCG中，為重組BCG-CP15/60-23疫苗的研究打下了基礎(chǔ)。 4.微小隱孢子蟲重組BCG-CP15/60-23疫苗免疫保護性的研究

13、 方法：100只BALB/c小鼠，按每組25只隨機分為4組，每只小鼠尾靜脈注射BCG-WT、BCG-PMV-262、BCG-PMV-262-CP-15/60-23(各0.1ml，含1×106個細菌)，對照組為PBS，共免疫3次，每次間隔2周，于每次免疫后2周重組BCG組尾靜脈取血分離血清(共3次)，用ELISA法檢測免疫血清中IgG抗體的動態(tài)變化；于第三次免疫2周后無菌取小鼠脾臟，研磨后，取1×106個脾細胞，分別加入超聲粉碎的BCG

14、-WT、BCG-PMV-262、BCG-PMV-262-CP-15/60-23(各10μg)，37℃5％CO2孵箱中培養(yǎng)72h，收集培養(yǎng)上清液用ELISA法檢測細胞因子IFN-γ、IL-2和IL-12等。 結(jié)果：1.BCG-PMV-262-CP-1523免疫后能刺激小白鼠產(chǎn)生IgG抗體，且隨著免疫次數(shù)的增加抗體滴度逐漸增高。2.各組小鼠脾細胞經(jīng)體外抗原刺激后，細胞因子IFN-γ與對照組相有顯著性差異(P＜0.05)。 結(jié)

15、論：重組BCG-CP15/60-23疫苗能刺激機體產(chǎn)生高滴度的IgG抗體，使脾細胞增生，體外能刺激免疫后的脾細胞產(chǎn)生保護性細胞因子IFN-γ。 總之，本研究完成了建立卵囊傳代的小鼠動物模型、純化卵囊的不連續(xù)蔗糖密度梯度離心法以及基因組的提取等內(nèi)容；構(gòu)建了原核表達載體pET-30a-23和pET-30a-15/60-23以及穿梭質(zhì)粒表達載體PMV-262-CP15/60-23，并成功地轉(zhuǎn)化到BCG中。通過誘導(dǎo)表達、純化、鑒定了CP