豬帶絳蟲重組BCG-TSOL18疫苗構(gòu)建及其免疫學(xué)特性研究.pdf

1、目的：本研究利用基因工程技術(shù)構(gòu)建豬帶絳蟲重組 Bacillus Calmette-Guérin（BCG）-TSOL18疫苗，研究TSOL18基因在BCG中的表達(dá)情況；然后將重組BCG-TSOL18疫苗免疫昆明小鼠，動態(tài)觀察免疫小鼠血清特異性IgG和IgG2a的變化規(guī)律，脾淋巴細(xì)胞增殖水平及脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-2和IL-4的水平，為該疫苗的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：將本室制備保存的重組質(zhì)粒pGEX-TSOL18經(jīng)BamH

2、Ⅰ和EcoRⅠ雙酶切后獲得 TSOL18目的基因，再將其定向克隆至大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達(dá)載體 pMV261中，構(gòu)建pMV261-TSOL18重組質(zhì)粒，采用電穿孔法將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BCG中，構(gòu)建豬帶絳蟲重組BCG-TSOL18疫苗，并進(jìn)行PCR鑒定；將重組BCG-TSOL18疫苗經(jīng)45℃熱誘導(dǎo)表達(dá)，通過SDS-PAGE鑒定和Western blot分析重組TSOL18蛋白的表達(dá)情況。然后將80只昆明小鼠隨機(jī)分成4組：①腹腔注射組，接種

3、5×106克隆形成單位（CFU）重組BCG-TSOL18疫苗100μl；②口服灌胃組，接種4×108 CFU重組BCG-TSOL18疫苗100μl；③和④分別為BCG和PBS對照組。于疫苗免疫后0、2、4、6和8w，收集血清和脾淋巴細(xì)胞，采用 ELISA法檢測血清特異性 IgG和 IgG2a水平及脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-2和IL-4水平；采用CCK-8法檢測脾淋巴細(xì)胞增殖水平。
　　結(jié)果：重組質(zhì)粒pGEX-TSOL18經(jīng)雙酶切鑒

4、定成功獲得393bp TSOL18目的基因；重組質(zhì)粒pMV261-TSOL18經(jīng)雙酶切、PCR和測序證實(shí)構(gòu)建成功；重組BCG-TSOL18疫苗經(jīng)PCR證實(shí)構(gòu)建成功；SDS-PAGE證實(shí)重組質(zhì)粒pMV261-TSOL18在BCG中經(jīng)熱誘導(dǎo)后能夠表達(dá)相對分子質(zhì)量（Mr）約為14.7kDa的重組TSOL18目的蛋白，Western blot分析示該重組蛋白有特異的抗原性。動態(tài)觀察表明：疫苗腹腔注射組和口服灌胃組小鼠血清特異性IgG和IgG2a

5、水平均在免疫后2～8w升高，均在免疫后6w達(dá)較高水平；脾淋巴細(xì)胞增殖水平均在免疫后2～8w升高，均在免疫后6w達(dá)較高水平；脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-2和IL-4水平均在免疫后2～8w和4～6w升高，均在免疫后6w和4w達(dá)較高水平。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建了豬帶絳蟲重組質(zhì)粒pMV261-TSOL18。
　　2.成功構(gòu)建了豬帶絳蟲重組BCG-TSOL18疫苗。
　　3.豬帶絳蟲TSOL18基因能在BCG中誘導(dǎo)表