豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴TSOL18基因密碼子優(yōu)化真核載體的構(gòu)建及其在體內(nèi)、外表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴期密碼子優(yōu)化TSOL18基因的重組核酸疫苗優(yōu)化PVAX1/TSOL18，觀察其在體外CHO-K1倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞亞株中的表達(dá)以及經(jīng)肌肉接種后在小鼠骨骼肌內(nèi)的表達(dá)，為豬帶絳蟲(chóng)囊尾蚴病DNA疫苗的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：按照哺乳動(dòng)物的密碼子使用偏好，對(duì)豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴TSOL18基因進(jìn)行優(yōu)化，使用GeneOptimizer軟件對(duì)TSOL18基因的氨基酸編碼基因進(jìn)行優(yōu)化，但不改變氨基酸。根據(jù)優(yōu)化后的基因序列

2、，由南京金思特科技有限公司進(jìn)行全基因合成。利用PCR擴(kuò)增該基因序列，將其插入真核表達(dá)載體PVAX1，經(jīng)酶切，測(cè)序鑒定。大量提取重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒優(yōu)化PVAX1/TSOL18經(jīng)梭華-SofastTM介導(dǎo)，體外轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR、細(xì)胞裂解物的SDS-PAGE電泳及Western-blotting分析檢測(cè)其在細(xì)胞內(nèi)是否有表達(dá)，再將密碼子優(yōu)化的PVAX1/TSOL18和PVAX1/TSOL18進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染繼以免疫組化法觀察

3、其在肌肉組織內(nèi)的表達(dá)效果并作比較。
　　 結(jié)果：優(yōu)化密碼子的PVAX1/TSOL18重組質(zhì)粒經(jīng)酶切電泳和測(cè)序結(jié)果與預(yù)期設(shè)計(jì)的基因序列一致。真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染后通過(guò)RT-PCR結(jié)果顯示目的條帶約為414bp; 真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染后通過(guò)SDS-PAGE電泳及Western-blotting檢測(cè)表明能夠在CHO-K1細(xì)胞中表達(dá)出約為18kDa的目的蛋白。免疫組化染色后在重組質(zhì)粒注射部位肌肉組織的肌纖維內(nèi)顯示棕黃色陽(yáng)性分泌顆粒，并且優(yōu)化PVAX1/