多頭帶絳蟲多頭蚴Tm7基因的克隆與原核表達.pdf

1、腦多頭蚴病是由多頭帶絳蟲(Teania Multiceps)的中絳期幼蟲腦多頭蚴(Coenurus cerebralis)寄生于綿羊、山羊和牛等動物腦、脊髓內引起的一種嚴重致死性人獸共患病。該病呈全球性分布，在我國主要以西北等牧區(qū)常見，給畜牧業(yè)造成巨大的經濟損失。目前本病的診斷主要是靠典型的臨床癥狀，若能找到一種敏感性和特異性較好的抗原用于診斷，則對于腦多頭蚴病的預防和治療有非常重要的意義。
　　 本試驗從腦多頭蚴的原頭蚴中提取

2、出總RNA，參照已報道的豬囊尾蚴診斷抗原NC-3基因(AJ012669)設計了一對特異性引物，應用反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術，擴增出了一條約400bp的片段。測序結果顯示Tm7基因與NC-3基因的相似性為97％，而與細粒棘球絳蟲EpC1基因(AF481884)有83％的相似性。本序列包含NC-3基因完整的開放閱讀框和EpC1基因的部分開放閱讀框，編碼由68個氨基酸組成的蛋白質，軟件分析表明該蛋白質的分子量為約7.6kDa，

3、等電點理論值為4.52，有較強的親水性。
　　 用EcoR I和Xho I雙酶切將Tm7基因從pMD18-T載體上切下，插入原核表達載體pET32a(+)，得到重組質粒pET32a(+)-Tm7，將其轉入表達菌大腸桿菌BL21(DE3)中，IPTG誘導表達。SDS-PAGE分析表明，在相對分子質量約27kDa處可見目的基因與表達載體的融合蛋白，而對照組pET32a(+)空質粒菌在此處沒有條帶。該蛋白在IPTG濃度為0.25mmo

4、l/L時于37℃誘導表達4h達到表達量的最大值。經Ni-親和層析柱純化后，得到純度較高的重組蛋白。免疫印跡試驗表明，羊腦多頭蚴病陽性血清能夠識別該抗原，說明重組蛋白有反應原性。
　　 以多頭帶絳蟲重組蛋白Tm7作為包被抗原，羊腦多頭蚴病陽性血清作為一抗，用HRP標記的兔抗羊IgG(HRP-兔抗羊IgG)為酶標二抗作間接ELISA來檢測羊血清中的腦多頭蚴抗體。通過對抗原包被濃度、抗體稀釋度、二抗?jié)舛?、各步驟作用時間等的摸索，得出了

5、重組抗原最適包被濃度為2.5μg/ml，血清稀釋度為1:40，一抗最佳反應時間為1h，酶標二抗工作濃度為1:5000，反應時間為37℃45min，底物37℃顯色15min。采用已確立的ELISA反應條件，檢測了12份陰性羊的血清，依據陰陽臨界值=陰性血清OD平均值+2SD，確定陰陽臨界值為0.7。用此方法檢測15份確診為腦多頭蚴病的羊血清，僅有1份OD值低于臨界值，敏感性為93.3％；對12份陰性血清檢測，均低于臨界值，對5份細頸囊尾蚴