人Tumstatin基因真核表達載體的構(gòu)建及其體內(nèi)表達抑制裸鼠U251移植瘤生長的實驗研究.pdf

1、中南大學博士學位論文人Tumstatin基因真核表達載體的構(gòu)建及其體內(nèi)表達抑制裸鼠U251移植瘤生長的實驗研究姓名：葉紅星申請學位級別：博士專業(yè)：神經(jīng)外科指導教師：袁賢瑞20090501中南大學博士學位論文中文摘要第一部分人Tumstatin基因真核表達載體的構(gòu)建目的構(gòu)建抗血管生成的入腫瘤抑素(Tumstatin)基因真核表達載體，為后續(xù)體外Tumstatin轉(zhuǎn)染U251細胞及其在荷瘤裸鼠(BALB／N)的體內(nèi)表達創(chuàng)造條件。方法1、從H

2、EK293細胞提取總RNA，通過RTPCR擴增出Tumstatin基因。2、將該基因?qū)肟寺≥d體pUC57T中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5Q進行擴增，并提取純化，對所獲重組質(zhì)粒進行酶切鑒定和DNA序列分析鑒定。3、用內(nèi)切酶NheI和NotI對重組質(zhì)粒pUC57Tumstatin雙酶切，并純化目的基因片段，同時用內(nèi)切酶NheI和NotI對質(zhì)粒pcDNA31()進行雙酶切。取純化的目的基因片段與表達載體pcDNA31()在T4連接酶的作用下進行連接

3、反應(yīng)。經(jīng)菌落PCR、酶切鑒定和DNA測序證實后，制備和純化重組質(zhì)粒。結(jié)果l、提取的RNA經(jīng)電泳有明顯的28S、18S、5S三條帶，分光光度法測得A260／A280=18933，提示RNA無明顯降解；RTPCR產(chǎn)物電泳顯示在750bp處有一特異性條帶。2、重組質(zhì)粒pUC57TumstatinDNA測序結(jié)果顯示插入的目的基因與GenBank收錄的人Tumstatin基因eDNA序列完全一致，無任何突變。3、重組質(zhì)粒pcDNA31Tumsta