大鼠Fas shRNA真核表達載體的構(gòu)建及其抑制腎小管上皮細胞Fas基因表達的實驗研究.pdf

1、目的: 構(gòu)建四個Fas shRNA真核表達重組質(zhì)粒，并檢測其對NRK-52E細胞(大鼠腎小管上皮細胞)Fas基因的沉默效率，篩選出一個最有效干擾質(zhì)粒。然后使用細胞因子刺激NRK-52E細胞，體外模擬腎小管上皮細胞在腎移植急性排斥反應(yīng)階段所處的環(huán)境。驗證該干擾質(zhì)粒在腎小管上皮細胞高表達Fas基因的情況下對該基因的抑制效果。為進一步研究RNA干擾技術(shù)在同種異體腎移植中誘導(dǎo)免疫耐受，保護供腎的作用奠定基礎(chǔ)。 方法: 1.Fas

2、 shRNA干擾靶點的選擇及轉(zhuǎn)錄模板DNA鏈的設(shè)計、合成：按照siRNA設(shè)計原則，在大鼠Fas基因mRNA上挑選四個干擾靶序列，EGFP的干擾序列采用Carl D.Novina等所提供的已經(jīng)驗證有效的序列；再根據(jù)靶序列分別設(shè)計并合成兩端含有酶切位點的總長度為64bp的shRNA轉(zhuǎn)錄模板DNA正、反義寡核苷酸鏈。 2.pSilencer Fas/EGFP shRNA表達載體的構(gòu)建：將正、反義寡核苷酸鏈煺火后克隆至經(jīng)酶切回收后的空載

3、體pSilencerTM3.1-H1 neo siRNA Expression Vector中。經(jīng)過PCR、酶切及測序鑒定后對重組質(zhì)粒分別命名為：pSilencerIFas1 shRNA、pSilencer-Fas2 shRNA、pSilencer-Fas3 shRNA、pSilencer-Fas4 shRNA及pSilencer-EGFP shRNA。 3.用LipofectamineTM LTX Reagent將pSilen

4、cer Fas(1.2.3.4)四個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E)內(nèi)，并以pSilencer-EGFP shRNA和pEGFP-N1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染來做陽性對照，陰性對照采用Ambion公司提供的陰性對照質(zhì)粒。經(jīng)過G418壓力性篩選后，使用RT-PCR和蛋白免疫印跡法分析針對Fas基因構(gòu)建的四個重組質(zhì)粒的有效性，篩選出最有效的干擾質(zhì)粒。 4.使用重組大鼠干擾素-γ(rr IFN-γ)和重組大鼠腫瘤壞死因子-α(rr

5、TNF-α)刺激NRK-52E細胞，體外模擬腎移植后急性排斥反應(yīng)階段腎小管上皮細胞Fas表達情況。分為正常細胞組，單加rr IFN-γ組(終濃度500U/ml)，單加rr TNF-α組(終濃度20ng/ml)，rr IFN-γ和rr TNF-α共刺激組(終濃度分別500U/ml和20ng/ml)四組，進行RT-PCR和蛋白免疫印跡法分析，檢測各組對Fas表達最的影響效果。 5.使用篩選出的Fas shRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染經(jīng)細胞因子

6、刺激過的NRK-52E細胞，進行RT-PCR和蛋白免疫印跡法分析，確定其在炎癥因子影響下對Fas基因的干擾效果。 結(jié)果: 1.PCR、雙酶切及測序證實pSilencer-Fas1 shRNA、pSilencer-Fas2 shRNA、pSilencer-Fas3 shRNA、pSilencer-Fas4 shRNA及pSilencer-EGFP shRNA五個鶯組子均構(gòu)建成功。 2.在陽性對照組中，經(jīng)pSilen

7、cer-EGFP shRNA和pEGFP-N1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的NRK-52E細胞熒光表達的數(shù)量及亮度均明顯低于pEGFP-N1單質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，證明了該載體介導(dǎo)RNA干擾的有效性。其余轉(zhuǎn)染組除pSilencer-Fas1 shRNA轉(zhuǎn)染組及陰性對照組外，F(xiàn)as基因的mRNA及蛋白表達水平均低于正常細胞組，經(jīng)過統(tǒng)計分析，最終確定pSilencer-Fas4 shRNA對Fas基因的抑制率最高，分別達到78.9％和64.5％。 3.使用重組

8、大鼠干擾素-γ(rr IFN-γ)和重組大鼠腫瘤壞死因子-α(rr TNF-α)刺激NRK-52E細胞。24-48h后，F(xiàn)as基因的mRNA及蛋白表達水平均高于正常細胞組，經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析，認為rr IFN-γ和rr TNF-α共刺激可使NRK-52E細胞Fas基因的表達量提高最顯著。在mRNA及蛋白水平分別達到正常細胞的2.37倍和2.53倍。 4.在細胞因子刺激的環(huán)境下,psilencer-Fas4 ShRNA 仍能夠使NRK

9、-52E細胞Fas基因的mRNA及蛋白表達量下降到正常細胞組的36.4％和44.2％。說明其在炎癥因子刺激的環(huán)境下，依然能夠有效抑制Fas基因的表達。 結(jié)論: 利用RNA干擾技術(shù)沉默大鼠Fas基因，可以降低大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E)Fas的表達；同時在體外模擬腎移植后急性排斥反應(yīng)階段，炎癥因子刺激的環(huán)境下依然能夠有效抑制Fas的表達。為進一步研究RNA干擾技術(shù)在同種異體器官移植中誘導(dǎo)特異性免疫耐受和保護移植物奠定了基礎(chǔ)