編碼大鼠RGMa的shRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建及其干擾效率的篩選鑒定.pdf

1、目的：中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元缺血缺氧損傷后再生極其困難，但近年研究表明，神經(jīng)元軸突在遭受缺血缺氧或機械損害后卻可以在干預(yù)因素下再生[1，2]，同時再生的軸突促使原受損軸突支配區(qū)域的功能恢復(fù)。鑒于離體細(xì)胞模型能更好的反映神經(jīng)元軸突的形態(tài)變化并便于研究者描述[3]，因此為了更好的觀察神經(jīng)元軸突的受損和干預(yù)后的再生狀態(tài)，建立準(zhǔn)確有效的軸突模型顯得必要。本研究利用無血清培養(yǎng)基體外培養(yǎng)[4]SD乳鼠海馬神經(jīng)元為基礎(chǔ)，建立軸突糖氧剝奪/復(fù)氧模型，為神經(jīng)

2、元糖氧剝奪/復(fù)氧后損傷及軸突再生的研究提供實驗依據(jù)。 方法：1.海馬神經(jīng)元培養(yǎng)無菌條件下取出生后24 h內(nèi)的乳鼠大腦海馬，使用巴氏管和340目篩網(wǎng)吹打及過濾，制備細(xì)胞懸液，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中[5]。在37℃、5％的二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）中培養(yǎng)，2.神經(jīng)元鑒定及純度檢測海馬神經(jīng)元培養(yǎng)6d后，NSE單克隆抗體免疫組化染色鑒定神經(jīng)元。陰性對照用0.01 mol/L PBS代替一抗。鏡下觀察，陽性細(xì)胞胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒沉

3、著。3.原代神經(jīng)元糖氧剝奪/復(fù)氧損傷模型制備[6]神經(jīng)元以24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，實驗分為正常對照組、糖氧剝奪/復(fù)氧組。正常對照組在常規(guī)條件下繼續(xù)培養(yǎng)；糖氧剝奪/復(fù)氧組分別為糖氧剝奪0.5、1.0、1.5 h后再復(fù)氧。制備模型前以平衡鹽緩沖液沖洗數(shù)次，使葡萄糖終濃度小于1mmol/ml。每孔加入100 ml無糖D-Hanks液，放人缺氧盒內(nèi)，持續(xù)緩慢通人含有95％ N2、5％ CO2的混合氣體分別0.5、1.0、1.5h，取出并吸棄平衡鹽緩沖

4、液，換以完全培養(yǎng)基孵育，置人CO2培養(yǎng)箱孵育。4.乳酸脫氫酶（LDH）的測定于不同時間點收集各組神經(jīng)元的培養(yǎng)液，使用LDH試劑盒進(jìn)行乳酸脫氫酶檢測，使用550型全自動酶標(biāo)儀（美國BioRad公司）。在波長440nm處檢測各管吸光度。 結(jié)果：1.神經(jīng)元生長及鑒定使用倒置相差顯微鏡觀察，接種初期海馬神經(jīng)元呈圓形，3～4 d細(xì)胞有明顯增長的突起并相互連接形成稀疏的網(wǎng)絡(luò)，6d神經(jīng)元細(xì)胞體進(jìn)一步增大，突起增粗增長，連接成網(wǎng)，細(xì)胞體突起光暈

5、明顯，立體感及折光性強。第6天的細(xì)胞，NSE免疫組化染色（DAB），細(xì)胞被染成棕褐色為陽性，不被染色的為陰性細(xì)胞。2.糖氧剝奪/復(fù)氧對海馬神經(jīng)元存活率以及LDH的影響，與正常對照組細(xì)胞比較，糖氧剝奪/復(fù)氧3組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力均升高且有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；在糖氧剝奪/復(fù)氧3組細(xì)胞之間，糖氧剝奪0.5 h后復(fù)氧，糖氧剝奪1.0 h后復(fù)氧和糖氧剝奪1.5 h后復(fù)氧，培養(yǎng)液LDH亦值有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。3.糖氧剝奪/復(fù)氧

6、對海馬神經(jīng)元軸突長度的影響在不同時間點觀察3組糖氧剝奪/復(fù)氧神經(jīng)元的生存狀況，發(fā)現(xiàn)糖氧剝奪0.5 h復(fù)氧后，神經(jīng)元存活率較高，同時軸突有變短尚未完全消失。其中軸突長度隨復(fù)氧時間延長而縮短，使用Image-Pro Plus6.0統(tǒng)計軸突長度，其中正常神經(jīng)元，糖氧剝奪0.5h，糖氧剝奪0.5h/復(fù)氧1h，糖氧剝奪0.5h/復(fù)氧5h，糖氧剝奪0.5h/復(fù)氧24h軸突長度分別76.27±19.63，70.34±12.30，65.97±16.91

7、，61.48±9.37，57.73±16.74（um），且各組之間軸突長度比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論：在糖氧剝奪/復(fù)氧模型的建立過程中，發(fā)現(xiàn)糖氧剝奪0.5 h再復(fù)氧后，神經(jīng)元存活率較高，同時軸突有變短尚未完全消失，由此顯示成功了建立神經(jīng)元的軸突糖氧剝奪模型。 目的：RGMa為一種膜蛋白，能特異性的與其受體Neogenin結(jié)合，激活下游的Rho kinas途徑使神經(jīng)元生長錐崩解，從而抑制了受損軸突的再生。目前

8、已報道使用RGMa蛋白抗體干預(yù)RGMa功能從而達(dá)到促進(jìn)受損后軸突再生的目的，而RNA干擾技術(shù)能在在基因水平上降解編碼RGMa蛋白的mRNA，降低其蛋白的翻譯從而達(dá)到阻斷RGMa-Neogenin途徑。本研究中，在離體細(xì)胞模型上面，使用RNA干擾技術(shù)，檢測RNAi對RGMa蛋白表達(dá)的影響，并篩選出最佳沉默效率的RNAi片段，為后繼的在體動物實驗打下基礎(chǔ)。 方法：1.表達(dá)RGMa-shRNA質(zhì)粒設(shè)計、構(gòu)建和酶切鑒定根據(jù)GenBank

9、中RGMa的核苷酸序列（No.NM_001107524）和shRNA設(shè)計原則，運用RNA設(shè)計軟件設(shè)計3對shRNA將化學(xué)合成的正義鏈和反義鏈加熱到94攝氏度退火獲得上游形成BamHⅠ位點、下游形成HindlⅡ位點的雙鏈DNA片段形成雙鏈的siRNA表達(dá)模板。以BamHⅠ、HindlⅡ雙酶切質(zhì)粒載體pgensil線性化，瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收酶切片段。將退火獲得的雙鏈DNA片段和酶切載體在T4 DNA連接酶作用下，4攝氏度過夜連接。取5

10、ul連接產(chǎn)物熱休克法轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5a，均勻涂抹在含30 ug/mL卡那霉素瓊脂平板上，倒置培養(yǎng)過夜。觀察菌落生長情況，過夜挑選單克隆菌落，接入3mLLB培養(yǎng)基中在37搖床中振蕩培養(yǎng)16 h，取3 mL菌液用OMEGA公司的質(zhì)粒小量提取試劑盒提取。取構(gòu)建的質(zhì)粒使用酶切鑒定和測序鑒定。2.PC12細(xì)胞的培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前1天用胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞并計數(shù)，將PC12細(xì)胞接種于6孔板中，在DMEM/F12培養(yǎng)基（含10％胎牛血清

11、）中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長接近培養(yǎng)板面積的80％時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將測序正確的質(zhì)粒菌液接入3mLLB培養(yǎng)基中，在37搖床中振蕩培養(yǎng)16 h，取3 mL菌液用OMEGA公司去內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒提取。共分5組空白組，陰性對照組，shRNA1組，shRNA2組，shRNA3組，使用脂質(zhì)體2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染（具體劑量按照說明書進(jìn)行）。3.使用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測干擾效果PCR：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h，檢測細(xì)胞RGMa mRNA的表

12、達(dá)。結(jié)果用Quantity One-4.4.0軟件行定量分析，以目的基因與β-actin條帶平均光密度比值表示目的基因mRNA的相對表達(dá)量。Western blotting：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后72 h，檢測細(xì)胞RGM-蛋白表達(dá)。將照片掃描輸入計算機，用Quantity One軟件掃描獲得光密度數(shù)值后定量分析。 結(jié)果：經(jīng)酶切和測序鑒定，成功的構(gòu)建了表達(dá)RGMa-shRNA質(zhì)粒，經(jīng)過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞后，使用RT-PCR和Western