細(xì)粒棘球絳蟲重組Bb-Eg95-EgA31疫苗構(gòu)建及其免疫機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 本研究擬從細(xì)粒棘球絳蟲（Eg）原頭節(jié)中擴(kuò)增出Eg95和EgA31抗原編碼基因，再通過基因拼接法（Gene SOEing）將兩個(gè)單基因融合，構(gòu)建Eg95-EgA31融合基因，并將其定向克隆到大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達(dá)載體pGEX-1λT，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-Eg95-EgA31，將該重組質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化兩歧雙歧桿菌（Bb）以及大腸埃希菌BL21（DE3），構(gòu)建細(xì)粒棘球絳蟲重組Bb-Eg95一EgA31疫苗，研究Eg9

2、5-EgA31融合基因在大腸埃希菌BL21（DE3）中的表達(dá)效率，探討重組Bb-Eg95-EgA31疫苗免疫小鼠后其免疫反應(yīng)的動態(tài)變化和對Eg原頭節(jié)攻擊的保護(hù)力及其免疫機(jī)制，為囊型棘球蚴?。–E）的防治提供一種安全高效的新型疫苗。
　　 方法：
　　 1.從細(xì)粒棘球蚴包囊中分離原頭節(jié)，超聲粉碎后提取總RNA為模板，通過RT-PCR分別擴(kuò)增Eg95和EgA31抗原編碼基因，然后采用GeneSOEing法剪接Eg95和EgA

3、31，得到Eg95-EgA31融合基因，再將其定向克隆到大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達(dá)載體pGEX-1λT中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-Eg95-EgA31，將該重組質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化Bb，構(gòu)建細(xì)粒棘球絳蟲重組Bb-Eg95-EgA31疫苗；將該重組質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21（DE3），經(jīng)異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)后用SDS-PAGE和Western blot對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析和鑒定。
　　 2.為了研究重組Bb

4、-Eg95一EgA31疫苗免疫小鼠后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠體內(nèi)體液免疫和細(xì)胞免疫的變化，將重組Bb-Eg95-EgA31疫苗口服灌胃或鼻腔粘膜接種免疫BALB/c小鼠，免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18和20w用ELISA法檢測血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE水平及脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平，MTT法檢測脾淋巴細(xì)胞的增殖，流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測脾C

5、D4+和CD8+T細(xì)胞百分率。
　　 3.為了研究重組Bb-Eg95-EgA31疫苗對Eg原頭節(jié)攻擊的保護(hù)力及其免疫機(jī)制，將重組Bb-Eg95-EgA31疫苗皮下注射、肌肉注射、鼻腔粘膜接種或口服免疫BALB/c小鼠，免疫后8周，用50個(gè)Eg原頭節(jié)經(jīng)腹腔注射攻擊，以空質(zhì)粒、Bb或MRS作對照，25周后處死小鼠，分離細(xì)粒棘球蚴包囊并稱重，計(jì)算囊重減少率，ELISA法檢測血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE

6、水平及脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平，MTT法檢測脾淋巴細(xì)胞的增殖，F(xiàn)CM檢測脾CD4+和CD8+T細(xì)胞百分率，Annexin V-FITC染色法檢測脾細(xì)胞凋亡發(fā)生率。
　　 結(jié)果：
　　 1.瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)Eg95（471bp）、EgA31（500bp）抗原編碼基因和Eg95-EgA31融合基因（1016bp）擴(kuò)增成功：雙酶切證實(shí)重組質(zhì)粒pGEX-Eg95-EgA31構(gòu)建成

7、功；PCR證實(shí)重組Bb-Eg95-EgA31疫苗構(gòu)建成功；SDS-PAGE證實(shí)重組質(zhì)粒pGEX-Eg95一EgA31在大腸埃希菌BL21（DE3）中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后能夠表達(dá)分子量為62.5KDa左右的重組Eg95-EgA31融合蛋白，IPT6誘導(dǎo)3～5h重組蛋白表達(dá)量最高，占菌體總蛋白的18％，Western blot證實(shí)該融合蛋白具有特異的抗原性。
　　 2.動態(tài)觀察表明：與0周未免疫小鼠相比，口服免疫組小鼠血清IgG、IgG

8、2a、IgG2b、IgG1、IgG3和IgE水平分別在免疫后8～10周、2～20周、2～20周、4～8周、6～12周和10周顯著升高，分別在免疫后8、2、6、6、8和10周達(dá)最高水平；脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平分別在免疫后2～16周、2～12周、2～6周和4～12周顯著升高，分別在免疫后4、2、4和6周達(dá)最高水平；脾淋巴細(xì)胞增殖水平在免疫后4～10周顯著升高，在免疫后6周達(dá)最高水平；脾CD4+

9、T細(xì)胞在免疫后4～10周顯著升高，在免疫后6周達(dá)最高水平，CD8+T細(xì)胞無明顯變化。鼻腔粘膜接種組小鼠血清IgG、IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG3和IgE水平分別在免疫后4～10周、4～20周、2～20周、2～12周、4～12周和10～12周顯著升高，分別在免疫后10、6、10、8、8和10周達(dá)最高水平；脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平分別在免疫后2～8周、2～12周、2～8周和6～16周

10、顯著升高，分別在免疫后2、2、4和8周達(dá)最高水平；脾淋巴細(xì)胞增殖水平在免疫后4～8周顯著升高，在免疫后6周達(dá)最高水平；脾CD4+T細(xì)胞在免疫后4～8周顯著升高，在免疫后6周達(dá)最高水平，CD8+T細(xì)胞無明顯變化。
　　 3.疫苗免疫加用Eg原頭節(jié)攻擊后發(fā)現(xiàn)，皮下注射組、肌肉注射組、鼻腔粘膜接種組和口服免疫組的囊重減少率分別為45.33％、41.33％、70.67％和62.67％；與對照組相比，免疫組小鼠血清IgG、IgG2a、Ig

11、G2b和IgG1水平顯著升高，IgG3和IgE水平顯著降低；脾IFN-γ、IL-12和TNF-α水平顯著升高，IL-10水平顯著降低；脾淋巴細(xì)胞顯著增殖；脾CD4+和CD8+T細(xì)胞顯著增加；脾細(xì)胞凋亡發(fā)生率顯著降低。鼻腔粘膜接種和口服灌胃是兩種較好的免疫途徑，且前者優(yōu)于后者。
　　 結(jié)論：
　　 1.通過RT-PCR成功擴(kuò)增出Eg95和EgA31抗原編碼基因。
　　 2.通過Gene SOEing法成功擴(kuò)增出Eg

12、95-EgA31融合基因。
　　 3.成功構(gòu)建了細(xì)粒棘球絳蟲重組質(zhì)粒pGEX-Eg95-EgA31。
　　 4.成功構(gòu)建了細(xì)粒棘球絳蟲重組Bb-Eg95-EgA31疫苗。
　　 5.細(xì)粒棘球絳蟲重組質(zhì)粒pGEX-Eg95-EgA31能在BL21（DE3）中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)效率為18％，且表達(dá)的重組Eg95-EgA31融合蛋白具有特異的抗原性。
　　 6.重組Bb-Eg95-EgA31疫苗可誘導(dǎo)小鼠