貝氏隱孢子蟲Rhomboid基因的生物信息學(xué)分析及其核酸疫苗的免疫保護(hù)效果研究.pdf

1、隱孢子蟲（Cryptosporidium）是一種重要的頂復(fù)門原蟲，主要寄生于宿主的呼吸道和消化道上皮細(xì)胞，引起隱孢子蟲病(Cryptosporidiosis)。該病在人、動(dòng)物和自然界中廣泛存在，對(duì)免疫功能低下的個(gè)體危害尤為嚴(yán)重，常導(dǎo)致持續(xù)性腹瀉或營(yíng)養(yǎng)不良，甚至危及生命。目前，對(duì)于隱孢子蟲病尚無有效防治措施，探索候選靶抗原的結(jié)構(gòu)和功能特性，從而制備特異性抗體和疫苗成為了該領(lǐng)域研究的新方向。
　　本研究將GenBank中發(fā)表的C.pa

2、rvum、C.hominis和C.muris的菱形體蛋白基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，設(shè)計(jì)合成該基因保守片段的1對(duì)特異性引物，以貝氏隱孢子蟲基因組DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增出CbROM基因保守片段，采用染色體步移技術(shù)獲得基因片段3'端和5'端未知核苷酸序列，對(duì)所得序列進(jìn)行測(cè)序并拼接。對(duì)所獲得序列的生物信息學(xué)分析表明，該基因的開放閱讀框大小為1422bp，編碼473個(gè)氨基酸，與C.parvum、C.hominis和C.muris的相應(yīng)基因進(jìn)行

3、比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，核苷酸同源性分別為68.2％、66.7％、59.6％，氨基酸序列同源性分別為61.8％、68.6％、51.6％。基因所編碼蛋白質(zhì)的理論分子量為52.7 kDa，等電點(diǎn)為8.65，是疏水性蛋白質(zhì)，含有7個(gè)串連的跨膜螺旋區(qū)，無信號(hào)肽;該基因含有典型的菱形體蛋白相關(guān)保守結(jié)構(gòu)域，屬于菱形體蛋白酶家族;功能位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，CbROM蛋白序列包含6個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，2個(gè)cAMP、cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，8個(gè)蛋白激酶C磷酸化

4、位點(diǎn)，7個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)和10個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn);二級(jí)結(jié)構(gòu)中包含α-螺旋38.27％，β-折疊16.70％和無規(guī)則卷曲45.03％。
　　以C.baileyi總RNA為模板，結(jié)合RT-PCR和巢氏PCR方法，擴(kuò)增CbROM基因，克隆至pMD18-T Simple載體，測(cè)序鑒定序列正確后，經(jīng)SacⅠ和KpnⅠ雙酶切，亞克隆至pEGFP-C2真核表達(dá)載體，構(gòu)建pEGFP-CbROM真核表達(dá)質(zhì)粒，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒

5、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入CEF細(xì)胞;通過共聚焦顯微鏡觀察和Western-Blot檢測(cè)，分析CbROM基因在體外表達(dá)情況。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-CbROM轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞48 h后，在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到較強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)，Western-Blot試驗(yàn)也成功檢測(cè)到了重組質(zhì)粒在體外的表達(dá)產(chǎn)物，在大小約為80 kDa處出現(xiàn)EGFP-CbROM融合蛋白特異性條帶，
　　用已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-CbROM免疫雛雞，觀察其對(duì)動(dòng)物機(jī)體誘導(dǎo)產(chǎn)生

6、的免疫應(yīng)答反應(yīng)，然后經(jīng)口接種貝氏隱孢子蟲卵囊進(jìn)行人工感染，評(píng)價(jià)該核酸疫苗對(duì)貝氏隱孢子蟲感染的免疫保護(hù)效果。結(jié)果表明，pEGFP-CbROM核酸疫苗可以使疫苗免疫組動(dòng)物血清中抗體水平和外周血液T淋巴細(xì)胞增殖能力與對(duì)照組相比顯著提高(P＜0.05)，而外周血液B淋巴細(xì)胞增殖能力僅在高劑量(100μg)重組質(zhì)粒免疫組與不免疫不感染組之間存在顯著差異(P＜0.05)。攻蟲后，中劑量(50μg)和高劑量（100μg）重組質(zhì)粒免疫組雛雞較其他組相比

7、排卵持續(xù)時(shí)間分別縮短2d和4d，疫苗免疫組之間的增重情況無顯著差異(P＞0.05)，但與非核酸疫苗免疫組之間差異顯著(P＜0.05)。
　　綜上所述，本研究首次獲得了CbROM基因全序列，并對(duì)其基因特征、理化性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測(cè)，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pEGFP-CbROM，并在體外檢測(cè)到了融合蛋白的正確表達(dá)，使用該重組質(zhì)粒作為核酸疫苗免疫雛雞，在高劑量（100μg）重組質(zhì)粒免疫組觀察到試驗(yàn)動(dòng)物對(duì)貝氏隱孢子蟲感染產(chǎn)生了一定免疫保護(hù)