剛地弓形蟲(chóng)蘋(píng)果酸脫氫酶基因的生物信息學(xué)分析、克隆表達(dá)及免疫保護(hù)性研究.pdf

1、目的:對(duì)剛地弓形蟲(chóng)蘋(píng)果酸脫氫酶(TgMDH)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并對(duì)該基因進(jìn)行克隆和表達(dá)，純化表達(dá)產(chǎn)物，分析其免疫原性;觀察重組弓形蟲(chóng)蘋(píng)果酸脫氫酶蛋白(rTgMDH)免疫小鼠誘導(dǎo)的黏膜及系統(tǒng)免疫應(yīng)答及其抗弓形蟲(chóng)感染作用，探討rTgMDH作為弓形蟲(chóng)疫苗候選抗原的可能性。
　　方法:(1)對(duì)TgMDH基因的主要特性及抗原表位進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用蛋白分析專(zhuān)家(ExPASy)提供的ProtParam、SOSUI、TMPRED、HN

2、N、MotifScan,NCBI上的ORF finder、Bcepred等生物信息學(xué)在線(xiàn)分析程序，結(jié)合Gene Runner、DNAMAN等生物信息學(xué)軟件，分析、預(yù)測(cè)TgMDH蛋白的理化性質(zhì)、可溶性、表面可及性、可塑性跨膜區(qū)翻譯后修飾位點(diǎn)、親（疏）水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原表位，通過(guò)SWISS-MODLE軟件預(yù)測(cè)該蛋白的三維結(jié)構(gòu)。(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a(+)-TgMDH，并在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性蛋白。對(duì)原核表達(dá)的rTgMDH進(jìn)行純

3、化及免疫原性分析。收集、純化RH株弓形蟲(chóng)速殖子，提取總RNA;設(shè)計(jì)合成引物并引入EcoRI和Xho I酶切位點(diǎn)，RT-PCR擴(kuò)增編碼TgMDH的基因片段克隆到原核表達(dá)載體pET30a(+)中，用雙酶切、PCR及測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆。在大腸桿菌BL21(DE3)中用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，以SDS-PAGE鑒定表達(dá)產(chǎn)物。以鎳離子親和層析柱對(duì)大量表達(dá)的rTgMDH進(jìn)行純化，以小鼠抗rTgMDH血清和兔抗弓形蟲(chóng)血清作為一抗，經(jīng)Western blot分

4、析其抗原性。(3)觀察不同劑量rTgMDH滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答。BALB/c小鼠40只隨機(jī)分為5組，分別用10μg、20μg、30μg、40μg rTgMDH/只滴鼻免疫BALB/c小鼠，免疫3次，一免與二免間隔14d，二免與三免間隔7d。rTgMDH溶于20μlPBS中，對(duì)照組用等量PBS滴鼻。末次免疫后14d，摘眼球采血，分離血清，采集小腸、鼻咽和膀胱沖洗液。ELISA法測(cè)定上述3種沖洗液中抗rTgMDH sIgA和

5、IgG及血清中抗rTgMDHIgA和IgG。分離脾淋巴細(xì)胞并培養(yǎng)，ELISA法測(cè)定培養(yǎng)24h脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-2、IL-4、IL-10和培養(yǎng)96h培養(yǎng)液上清中IFN-γ。(4)觀察30μg rTgMDH滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的抗弓形蟲(chóng)感染作用。BALB/c小鼠60只，隨機(jī)分為免疫組和對(duì)照組，每組30只。各組內(nèi)慢性感染小鼠8只，急性感染小鼠22只。用30μgrTgMDH溶于20μl PBS中滴鼻免疫對(duì)照組小鼠3次，對(duì)照組用等量PBS滴

6、鼻。末次免疫后第14d，分別用8×104速殖子/只和9×105速殖子/只灌胃感染小鼠，觀察慢性感染和急性感染時(shí)小鼠的健康及存活狀況。攻擊感染后一個(gè)月，計(jì)數(shù)小鼠肝、腦組織內(nèi)弓形蟲(chóng)速殖子數(shù)。
　　結(jié)果:(1)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，剛地弓形蟲(chóng)MDH有9個(gè)表面可及性參數(shù)≥1.9的區(qū)域、4個(gè)親水性參數(shù)≥1.9的區(qū)域、7個(gè)柔韌性參數(shù)≥2的區(qū)域、14個(gè)翻譯后修飾位點(diǎn)、14個(gè)潛在抗原表位，可能具有免疫原性。(2)以RH株弓形蟲(chóng)速殖子的cDNA為模板

7、，擴(kuò)增獲得951 bp的TgMDH基因片段，并成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a(+)-TgMDH; IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)SDS-PAGE分析表明，目的基因在大腸桿菌BL21中高效表達(dá)，相對(duì)分子量約36 kDa。Western blot顯示，純化后的rTgMDH能被小鼠抗rTgMDH血清和兔抗弓形蟲(chóng)血清識(shí)別，具有抗原性。(3)不同劑量rTgMDH滴鼻免疫小鼠，均不同程度誘導(dǎo)了小鼠特異性免疫應(yīng)答。與對(duì)照組相比，免疫組小鼠的血清sIgA及鼻咽沖洗液、

8、膀胱沖洗液和小腸沖洗液IgA水平高于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.773，P＜0.01; F=33.41，P＜0.01;F=9.289,P＜0.01;F=5.877，P＜0.01);免疫小鼠的IgG水平高于對(duì)照組，其中血清、鼻咽沖洗液和膀胱沖洗液IgG水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.935，P＜0.01; F=28.386，P＜0.01;F=8.061，P＜0.01)，尤以30μg、40μg組顯著。各免疫組小腸沖洗液IgG水平與對(duì)照

9、組相比均無(wú)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子增加，與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(IL-2;F=43.967，P＜0.01;IL4:F=7.28,P＜0.01;IL-10:F=12.91，P＜0.01)，尤以30μg組顯著。免疫組IFN-γ水平增高，與對(duì)照組相比，也具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.063，P＜0.05)，尤以30μg、40μg組顯著。30μg組可以更有效地誘導(dǎo)黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答。(4)經(jīng)30μg rTgMDH滴

10、鼻免疫的小鼠在攻擊感染后第7天，出現(xiàn)豎毛、倦怠、活動(dòng)減少、飲水及采食減少。在急性感染組，免疫小鼠的存活率為52.38％，對(duì)照組存活率為31.82％，慢性感染小鼠則全部存活。免疫組小鼠肝組織內(nèi)蟲(chóng)荷（速殖子數(shù)）低于對(duì)照組（F=24.98，F(xiàn)=46.249，P＜0.01）。
　　結(jié)論:(1)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)剛地弓形蟲(chóng)MDH有14個(gè)潛在的抗原表位，可能具有免疫原性。(2)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a(+)-TgMDH，并在大腸桿菌中高效