基于絲網(wǎng)印刷技術(shù)的蘋果酸脫氫酶電極設(shè)計.pdf

1、L-蘋果酸是普遍存在于動物、植物及微生物體內(nèi)的一種重要羧酸，在細胞內(nèi)參與多種生命活動，在食品、醫(yī)藥以及化工等領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用。對于L-蘋果酸的定量檢測，目前主要包括色譜法、光譜法、酶法等，這些方法雖然能夠滿足測定精確度的要求，但一般步驟繁瑣、成本較高。
　　蘋果酸脫氫酶（MDH）在存在其輔酶NAD(P)+時可在生理條件下催化蘋果酸的轉(zhuǎn)化及NAD(P)H的生成。利用對NAD(P)H敏感的電化學(xué)傳感器對其進行檢測，可以實現(xiàn)對L-蘋果

2、酸的定性定量分析。根據(jù)這一原理可以通過將蘋果酸脫氫酶固定于NADH敏感電極表面形成電流型酶電極的途徑解決L-蘋果酸的定量檢測問題。
　　本文將蘋果酸脫氫酶同殼聚糖、戊二醛制成固定化酶制劑，并將其整合至由碳納米管修飾的電化學(xué)基底電極表面構(gòu)成酶電極，得到對L-蘋果酸敏感的酶生物傳感器：
　?。?）利用魚精蛋白（Pr）與多壁碳納米管（CNT）形成穩(wěn)定的復(fù)合物，以此復(fù)合物對絲網(wǎng)印刷電極（SPE）的工作表面進行修飾，獲得碳納米管功能化

3、的絲網(wǎng)印刷電極Pr/CNT/SPE。通過表面微觀結(jié)構(gòu)表征發(fā)現(xiàn)，魚精蛋白的應(yīng)用使碳納米管修飾電極表面形成了穩(wěn)定、致密的微觀結(jié)構(gòu)，顯著提高了修飾電極對 NADH的電催化性能。修飾電極對NADH在2-1500μmol/L的范圍內(nèi)存在線性響應(yīng)，回歸方程i(μA)=-1.8764c(mmol/L)-0.0516，R2=0.984。響應(yīng)時間為6 s，靈敏度為1.8764μA·L/mmol/Lol，檢測限為0.05μmol/L(S/N=3)。實驗還確

4、定了最佳的Pr/CNT質(zhì)量分?jǐn)?shù)，確定Pr/CNT質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5作為制備Pr/CNT/SPE的最佳方案。
　?。?）以Pr/CNT/SPE作為基底電極構(gòu)建對L-蘋果酸靈敏的電化學(xué)酶電極。以戊二醛（GDI）對殼聚糖（CHIT）進行改性處理，獲得表面保留有自由醛基的酶固定化載體。將MDH同此固定化載體以合適的比例混合可以得到固定化酶CHIT-GDI-MDH。以此固定化酶修飾Pr/CNT/SPE，并以核微孔膜防止固定化酶的泄漏，即得完整

5、的蘋果酸脫氫酶電極CHIT-GDI-MDH/Pr/CNT/SPE。該酶電極對5-300μmol/L內(nèi)的L-蘋果酸存在線性響應(yīng)，其可用以定量檢測的回歸方程為i(μA)=-0.69c(mmol/L)-0.0024（R2=0.995）。響應(yīng)時間為6-8 s，檢測靈敏度為0.69μA·L/mmol；檢測限為0.03μmol/L(S/N=3)。實驗還對酶電極的抗干擾性能進行了評估，發(fā)現(xiàn)酶電極具備一定的抗干擾性能，適合用于實際樣本中L-蘋果酸的分析

6、檢測。
　?。?）酶電極的制備方法及檢測條件優(yōu)化。選取CHIT-GDI:MDH比例、pH、工作電位以及測試溫度4個因素作為實驗變量，首先通過單因素實驗分析了其各自對酶電極傳感性能的影響并確定出其各自的最佳水平。隨后，再以4個因素進行正交試驗，進一步尋找最優(yōu)方案。結(jié)果顯示，CHIT-GDI-MDH/Pr/CNT/SPE的最佳制備方法及工作條件為：以每30U MDH同100μL CHIT-GDI混合制備CHIT-GDI-MDH，選用p