Cytophaga hutchinsonii α-異丙基蘋(píng)果酸合酶酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、木質(zhì)纖維素是自然界廣泛存在且廉價(jià)的可再生資源,其主要成分纖維索、半纖維素是潛在的燃料丁醇生產(chǎn)原料。自然界存在大量可降解纖維素的微生物,包括細(xì)菌、放線菌、真菌等。哈氏嗜纖維菌（Cytophaga hutchinsoni)屬于嗜纖維菌屬,是一種可快速降解結(jié)晶纖維素的細(xì)菌,因其對(duì)纖維素高效的降解能力、獨(dú)特的降解機(jī)制以及運(yùn)動(dòng)特性等引起人們的普遍重視。美國(guó)能源部已完成對(duì)該菌全基因組序列的測(cè)定。目前對(duì)該菌的研究主要集中在纖維素降解機(jī)制與滑動(dòng)特性等方

2、面,而對(duì)其進(jìn)行代謝改造直接用于生物燃料生產(chǎn)的報(bào)道較少。
　　 傳統(tǒng)的梭菌厭氧發(fā)酵僅能產(chǎn)生直鏈1-丁醇,并且產(chǎn)量也不夠理想。利用代謝工程技術(shù),通過(guò)對(duì)包括大腸桿菌在內(nèi)的氨基酸生物合成途徑進(jìn)行改造,可以生產(chǎn)分子鏈含碳原子個(gè)數(shù)為3至5的多種醇類(lèi),其中具有良好特性的異丁醇收率較高。這一研究進(jìn)展為進(jìn)一步探索轉(zhuǎn)化生物質(zhì)資源生產(chǎn)各種高級(jí)醇奠定了基礎(chǔ)。在代謝工程改造氨基酸合成途徑形成異丁醇的策略中,亮氨酸合成途徑的α-異丙基蘋(píng)果酸合酶(α-IPM

3、S)尤為重要。該酶由leuA基因編碼,可催化氨基酸合成的中間產(chǎn)物α-酮異戊酸接受乙酰輔酶A的乙酰基形成α-異丙基蘋(píng)果酸,再經(jīng)α-異丙基蘋(píng)果酸脫水酶、異丙基蘋(píng)果酸脫氫酶的催化產(chǎn)生α-酮異己酸。這一酶系同樣可催化α-酮丁酸生成α-酮戊酸。而α-酮戊酸可在α-酮酸脫羧酶(KDC)與醇脫氫酶(ADH)作用下進(jìn)一步生成具有廣闊應(yīng)用前景的新型燃料--丁醇。
　　 本研究的目的是通過(guò)研究C.hutchinsoniiα-異丙基蘋(píng)果酸合酶的酶學(xué)性

4、質(zhì),為以后在C.hutchinsonii中探索開(kāi)展代謝工程改造奠定基礎(chǔ)。根據(jù)公開(kāi)的基因組序列注釋信息,發(fā)現(xiàn)C.hutchinsonii中Leu ABCD（亮氨酸合成酶系）的編碼基因形成一個(gè)操縱子。通過(guò)PCR擴(kuò)增得到了C.hutchinsonii的leuA基因,并將此基因編碼的α-IPMS蛋白在大腸桿菌中進(jìn)行了異源表達(dá)。為了進(jìn)行比較,將來(lái)源于E.coli的α-IPMS蛋白也進(jìn)行了重組表達(dá)。通過(guò)對(duì)酶學(xué)動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析比較發(fā)現(xiàn)E.coliα-I

5、PMS對(duì)兩個(gè)底物的Km比C.hutchinsonii的α-IPMS都小,并且催化效率也是E.coliα-IPMS較高。在將C.hutchinsoniiα-IPMS蛋白同源模建得到的三級(jí)結(jié)構(gòu)和己報(bào)道的M.tuberculosisα-IPMS蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較的基礎(chǔ)上,選擇了3個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸進(jìn)行了基因突變并對(duì)突變體進(jìn)行了重組表達(dá)與純化。比較突變前后酶活性發(fā)現(xiàn),三個(gè)突變體的比酶活相對(duì)突變前均大幅下降,顯示這幾個(gè)位點(diǎn)對(duì)酶催化活性的發(fā)揮具有重