引起腫瘤細(xì)胞自噬的小分子化合物的發(fā)現(xiàn)及其機(jī)制研究.pdf

1、自噬是發(fā)生在真核細(xì)胞中由細(xì)胞初級(jí)溶酶體處理內(nèi)源性底物的重要生理過程，生命體借此維持蛋白質(zhì)代謝平衡及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。自噬不僅對(duì)細(xì)胞清除廢物、重建結(jié)構(gòu)以及生長(zhǎng)發(fā)育起重要作用，還與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。發(fā)現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞自噬的小分子抗腫瘤化合物，為新型抗腫瘤藥物發(fā)現(xiàn)打下基礎(chǔ)。 本文成功建立了在HCT-116細(xì)胞上自噬篩選的模型。選擇HCT-116、HeLa等細(xì)胞轉(zhuǎn)染pGFP-LC3質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后加入新霉素抗性維持培養(yǎng)至被轉(zhuǎn)染的目的基因穩(wěn)定

2、整合到細(xì)胞的基因組中，形成單細(xì)胞克隆，挑選出帶有熒光的細(xì)胞克隆，用化合物長(zhǎng)春堿檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬發(fā)生的程度，熒光顯微鏡觀察GFP標(biāo)記的LC3在細(xì)胞內(nèi)的定位分布變化：由胞漿內(nèi)彌散分布變?yōu)槌庶c(diǎn)狀分布于自噬泡的周圍，同時(shí)免疫印跡檢測(cè)LC3條帶的變化：由LC3Ⅰ變?yōu)長(zhǎng)C3Ⅱ。 利用上述模型，從化合物庫(kù)里100多個(gè)具有抗腫瘤活性的化合物中挑選出28個(gè)在HCT-116細(xì)胞上的IC50在5.5μg/ml以下的化合物，以3倍IC50、9倍IC50的

3、化合物濃度與HCT-116細(xì)胞孵育24 h，收集細(xì)胞樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)。初篩得到11個(gè)有自噬活性的化合物，復(fù)篩得到6個(gè)有明顯自噬活性的化合物，選擇其中的一個(gè)化合物進(jìn)行機(jī)制方面的研究。 該化合物名稱為physalinB，在多種細(xì)胞里有抗腫瘤活性。MTT法檢測(cè)了其在HCT-116細(xì)胞中的抗腫瘤活性，Western blot檢測(cè)其誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞的自噬具有明顯的時(shí)間、濃度依賴性，熒光顯微鏡觀察其引起了HCT-116穩(wěn)定細(xì)

4、胞株內(nèi)綠色熒光呈點(diǎn)狀分布于自噬泡的周圍。Western blot檢測(cè)到自噬信號(hào)通路相關(guān)蛋白AKT的磷酸化降低、ERK的磷酸化水平增加及mTOR的磷酸化水平降低，Becin-1蛋白的表達(dá)量并沒有增加，而且該化合物所引起的自噬不能被經(jīng)典的自噬的抑制劑3—MA所阻斷，可以被ERK的抑制劑PD98059反轉(zhuǎn)，同時(shí)檢測(cè)到凋亡早期蛋白PARP的剪切并能被caspase的抑制劑Z—VAD—FMK反轉(zhuǎn)。 該化合物引起自噬的信號(hào)通路是Ⅰ型的P13