小分子化合物介導譜系重編程獲取內胚層祖細胞及其相關機制研究.pdf

1、干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞，由于能夠生成功能成熟的終末細胞，因此在器官組織再生、疾病模型建立、發(fā)育生物學及藥物研發(fā)等領域具有非常廣闊的應用前景。這其中又以胚胎干細胞（ESCs）最早受到關注， ESCs具有無限的自我更新和向成體所有細胞進行分化的潛能，因此是細胞治療的良好種子細胞。然而ESCs應用面臨倫理學的困境，免疫排斥和致畸胎瘤的問題。2006年 Yamanaka使用多能性轉錄因子 OCT4，SOX2，KLF4和 c

2、-MYC（OSKM）成功的將成纖維細胞重編程（Reprogramming）為誘導多能性干細胞（iPSCs）。iPSCs避免了ESCs的倫理學爭議、免疫排斥問題，但依然難以回避致畸胎瘤的風險。近年來使用多種不同的誘導方式使細胞命運發(fā)生轉換的譜系重編程技術（Lineage Reprogramming）在整個干細胞與再生醫(yī)學領域，吸引了廣泛的關注并成為獲取干細胞和功能成熟細胞的前沿和極具價值的技術策略。與iPSCs及其來源的細胞相比，line

3、age reprogramming獲取的細胞具有多方面的優(yōu)勢和特點。Lineage reprogramming獲取細胞不經過多能性階段，直接實現(xiàn)胚層內或胚層間的細胞類型轉換，因此不具有成畸胎瘤的潛在風險。由于細胞發(fā)生直接的命運轉換，不需要多步的誘導分化，由此獲得的細胞類型更為均一可控，臨床應用也更加安全。此外，Lineage reprogramming同樣具有iPSCs個體特異性，移植后不具有免疫排斥的優(yōu)勢。長期以來譜系重編程最常用的策

4、略是在成體細胞中過表達靶細胞譜系特異性的轉錄因子，結合相應的誘導培養(yǎng)條件，建立靶細胞的基因調控網(wǎng)絡，從而實現(xiàn)細胞命運轉化。利用這種方式在內，中，外三個胚層的多個細胞類型之間實現(xiàn)了命運轉換。然而，目前譜系重編程的主要策略仍然是依賴于病毒載體介導轉錄因子過表達的方式，因此會不可避免的存在病毒載體基因在目的細胞基因組中的整合，進而導致目的細胞基因組的不穩(wěn)定，從而造成細胞移植入體內后帶來長期的安全性隱患。因此，尋求非整合方式的譜系重編程策略，來

5、替代病毒介導轉錄因子的過表達，將是譜系重編程走向臨床應用的必經之路。
　　小分子化合物是一類可自由通透細胞，性狀穩(wěn)定，質量可控，可調和作用時間和作用強度，非整合性及無免疫源性的化合物，因此是一類非常安全的具有巨大臨床應用前景的譜系重編程方式。近期，完全使用小分子組合已成功的將小鼠成纖維細胞重編程到誘導多能性干細胞、神經細胞、神經干細胞；將人的成纖維細胞、星狀細胞重編程為神經元，心肌細胞。然而目前還沒有將人或鼠的體細胞重編程到內胚層

6、祖細胞的先例。而且小分子化合物誘導iPSCs產生的機制才初步闡明，小分子化合物介導譜系重編程的機制尚不清楚。針對這些關鍵的科學問題，我們針對起始細胞的選擇、小分子化合物及滋養(yǎng)層細胞的篩選進行了系統(tǒng)研究，最終成功的使用確定的小分子組合在特定的滋養(yǎng)層細胞的支持下，將人的胃上皮細胞（hGECs）重編程到誘導內胚層祖細胞階段（hiEndoPCs），并對hiEndoPCs的生物學特性以及hGECs向hiEndoPCs譜系重編程的機制進行了深入系統(tǒng)

7、的研究?；谝陨蟽热?，本課題分為三部分，第一部分建立小分子化合物誘導人胃上皮細胞重編程為內胚層祖細胞的體系；第二部分鑒定誘導內胚層祖細胞的表型及分化潛能；第三部分是對人胃上皮細胞向誘導內胚層祖細胞重編程過程中的機制進行深入研究，揭示各影響因素的作用機制。
　　一、小分子化合物誘導人胃上皮細胞向內胚層祖細胞轉換的體系建立
　　我們分離培養(yǎng)人胃和十二指腸來源的上皮細胞來作為譜系重編程的起始細胞，通過初步篩選的八個小分子組合：SB

8、431542+VPA+PD0325901+RG108+BIX01294+Bay K8644+PS48+FBP，并在人消化道來源的肌成纖維細胞作為滋養(yǎng)層的條件下可以將胃上皮（hGECs）或十二指腸上皮細胞（hDECs）重編程為內胚層祖細胞樣的克隆。我們以能夠出現(xiàn)內胚層祖細胞樣克隆為標準，然后對重編程的體系—小分子化合物和滋養(yǎng)層細胞進行了優(yōu)化，最終確定四個小分子組合：BIX01294+Bay K8644+RG108+SB431542（BBR

9、S）為最優(yōu)的小分子組合。由于滋養(yǎng)層細胞—人胃肌成纖維細胞(GSEMFs)的獲取最為便利，因此我們確立了重編程最優(yōu)的體系是BBRS+GSEMFs，在這樣的體系中重編程的效率為~5％。我們也發(fā)現(xiàn)能夠實現(xiàn)重編程的最少小分子組合是 SB431542。此外，我們還證實了hiEndoPCs來源于NCAM陽性的hGECs，實現(xiàn)了起始細胞的精確定位。
　　二、誘導內胚層祖細胞的表型鑒定及分化潛能研究
　　我們首先檢測了常見的內胚層祖細胞特征

10、性的轉錄因子 FOXA2、SOX9、HNF1B、PDX1、GATA4，其他干/祖細胞特征性蛋白包括CXCR4、EPCAM、LGR5、CK19以及胃上皮特異性的標志MUC6、GASTRIN等在hiEndoPCs中的表達情況，發(fā)現(xiàn)與hGECs相比內胚層標志性的基因在hiEndoPCs中明顯上調，而胃特異性的基因則不表達，初步證實了 hGECs向內胚層祖細胞重編程的成功。表觀遺傳分析也顯示重編程后細胞發(fā)生了顯著改變，具備了內胚層祖細胞的分子特

11、征。對 hiEndoPCs的發(fā)育階段進行精確定位，深度測序的結果顯示 hiEndoPCs處于hESCs來源的原始消化管（PGT）和前腸后段（PFG）這兩個內胚層發(fā)育階段之間，且更接近PFG。此外，hiEndoPCs具有干細胞微觀水平的特征并能進行4-6次的傳代擴增。由于發(fā)育過程中內胚層祖細胞具有向胰腺、肝臟、腸、肺和甲狀腺等內胚層器官進行分化的潛能，因此我們使用相應的誘導分化條件發(fā)現(xiàn)hiEndoPCs同樣具有形成功能性胰腺β細胞、肝細胞

12、、腸道細胞、肺細胞和甲狀腺細胞的能力。
　　通過對 hiEndoPCs的表型分析、生物信息學分析以及內胚層分化潛能的評價，我們明確證實了hiEndoPCs的內胚層祖細胞特性以及hGECs向hiEndoPCs重編程的成功。
　　三、胃上皮細胞向誘導內胚層祖細胞重編程的機制研究
　　由于在我們的重編程體系中，小分子化合物和滋養(yǎng)層細胞這兩個因素是不可或缺的，因此我們首先對小分子可能的作用機制進行了探究，發(fā)現(xiàn) TGF-β信號通

13、路的抑制是必須的，也是能夠保證重編程成功的最少小分子組合，也就是說TGF-β信號通路抑制介導的上皮特性的維持在重編程的過程中是必須的，然而我們發(fā)現(xiàn)早期的上皮間質轉換（EMT）和隨后的間質上皮轉換（MET）也存在于重編程的過程中。重編程的另一個關鍵因素是滋養(yǎng)層細胞的作用，對滋養(yǎng)層細胞的分泌蛋白表達譜分析顯示促進細胞周期加速的蛋白高表達，在滋養(yǎng)層細胞的作用下 hGECs細胞周期明顯加快，提示了細胞周期的加速有助于重編程的發(fā)生。此外Wnt信號