用于人造血干細胞體外擴增的小分子化合物篩選及作用機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 用于小分子化合物篩選的單個hHSC體外培養(yǎng)體系建立
　　造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)是目前研究最為深入的一類干細胞，它具有自我更新及多向分化兩大重要特點，能夠在保持干細胞池相對穩(wěn)定的同時增殖分化為復雜造血系統(tǒng)中的各系血細胞。然而，HSCs在骨髓及臍帶血中比例極低，基礎(chǔ)研究及臨床移植中用到的HSCs又多為異質(zhì)性的細胞群體，即HSCs及定向

2、分化的造血祖細胞混合體，雖然臍帶血的應(yīng)用大大降低了臨床用造血干細胞對組織相容性抗原(HLA)的要求，但臍帶血仍無法滿足成人移植所需的造血干細胞量?；诖?，臨床移植面臨HSCs數(shù)目不足及移植用HSCs無統(tǒng)一的質(zhì)量標準等問題亟待解決。小分子化合物在HSCs調(diào)控領(lǐng)域以其濃度可精確調(diào)控、結(jié)構(gòu)多樣方便優(yōu)化、易于處理等特點顯示出極大優(yōu)勢，已有研究證實，SR1及UM71兩種小分子化合物單獨使用及組合使用均可顯著擴增HSPCs(hematopoieti

3、c stem/progenitorcells)，其擴增倍數(shù)可達到100倍以上。近年興起的單細胞技術(shù)，可有效解決細胞異質(zhì)性問題，細胞表面標記研究結(jié)合先進的流式細胞分選平臺，使得純化獲取單個hHSC成為可能。已有研究表明，造血干細胞的表面標記除了經(jīng)典的CD34、CD38外，CD90、CD45RA以及HSCs特異性標記CD49f,的表面標記組合可將HSCs與造血祖細胞充分區(qū)分開來，從而獲得單純的HSCs。體外造血功能實驗CFC(colonyf

4、orming cells)及CAFC(cobblestone area forming cells)可用于體外驗證HSCs功能，其中CFC側(cè)重于觀測多能祖細胞的分化能力，CAFC可反映培養(yǎng)系統(tǒng)中具有長期造血重建能力的HSCs。
　　目的:本研究主要通過利用對HSCs有明顯擴增作用的小分子化合物SR1及UM171，構(gòu)建多參數(shù)單細胞的流式分選及培養(yǎng)體系，通過對分選得到的單個hHSC體外培養(yǎng)后流式檢測及形態(tài)分析，以及體外造血功能實驗，驗

5、證本單個hHSC體外培養(yǎng)體系的穩(wěn)定性和可靠性，以便用于后續(xù)調(diào)控HSCs功能的小分子化合物篩選。
　　方法:首先，通過CD34+細胞體外培養(yǎng)確定SR1及UM171的使用濃度，再通過實驗摸索得到單細胞培養(yǎng)最適宜的培養(yǎng)基體系，利用BD INFLUX流式分選儀將單個DAPI-CD34+CD38-CD90+CD45RA-CD49f+細胞分選到96孔板中進行14d體外培養(yǎng)，并完成培養(yǎng)后流式分析及細胞形態(tài)檢測，分析單個hHSC培養(yǎng)體系中小分子化

6、合物的作用。利用經(jīng)典的體外造血功能實驗作一對比，以此驗證體系的穩(wěn)定性。
　　結(jié)果: CD34+細胞體外培養(yǎng)確定了化合物使用濃度為SR1(1μmol/L)，UM171(35nmol/L)，SR1+UM171(750nmol/L+35nmol/L)。單個hHSC體外培養(yǎng)14天流式結(jié)果顯示，化合物處理組較對照組相比，有效孔數(shù)明顯增加，在各孔細胞總數(shù)無明顯差異的情況下，化合物處理組CD34+細胞及CD34+CD49f+細胞絕對數(shù)及比例顯著

7、增高（P＜0.05），幾乎所有有效孔細胞均向髓系、淋系兩大方向分化，未出現(xiàn)偏系分化，細胞染色結(jié)果與流式檢測結(jié)果一致。CFC結(jié)果顯示，處理組克隆總數(shù)及各種克隆數(shù)目較對照組顯著增加，且克隆形態(tài)及各種克隆比例無差異。CAFC泊松分布結(jié)果表明，處理組HSCs頻率較對照組明顯上升(P＜0.05)。
　　結(jié)論:此構(gòu)建的單個hHSC體外培養(yǎng)體系可保證SR1及UM171處理條件下，HSC保持自我更新同時仍具有多向分化潛能，縮短了體外擴增及驗證性實

8、驗周期，初步解決了HSCs研究面臨的異質(zhì)性問題，為之后篩選靶向HSC的小分子化合物奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分 化小分子化合物用于hHSCs體外擴增的研究
　　HSCs在早期發(fā)育及生命過程中，發(fā)揮著維持組織穩(wěn)態(tài)等生理學功能。其自我更新及多向分化兩大特性之間的平衡，對于HSCs的功能起著至關(guān)重要的作用。近年來對于胚胎干細胞及成體干細胞的研究發(fā)現(xiàn)，這一平衡可以由活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)

9、來調(diào)節(jié)，ROS可以改變細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，實現(xiàn)代謝的同步性。但是，研究證實，HSCs在低氧環(huán)境生存，較低的ROS水平可以幫助維持長期HSCs的生物學功能，提高移植成功率。HSCT不僅需要保證細胞的功能，還需要有用于移植的足夠數(shù)量的細胞，這也是急需解決的一個問題。人體的抗氧化防御系統(tǒng)是一個復雜的系統(tǒng)，它能夠維持較低的ROS水平，同時確保機體內(nèi)的ROS作為第二信使行使信號傳導功能，此系統(tǒng)如不能完成恰當?shù)难趸€原調(diào)控，可能會造成ROS水平升

10、高導致氧化應(yīng)激發(fā)生，需要有外界抗氧化物介入調(diào)節(jié)。
　　目的:通過對抗氧化小分子化合物庫中的85種小分子化合物進行篩選，得到對HSCs有明顯體外擴增作用的幾種小分子化合物，并初步驗證其對HSCs生物學功能的影響，進而研究其抗氧化作用機制。
　　方法:首先由于小分子化合物庫中的抗氧化物在HSCs領(lǐng)域未有報道，需要利用CD34+細胞體外擴增的方法，確定化合物的使用濃度，經(jīng)過初篩以及設(shè)計化合物濃度梯度，體外培養(yǎng)后流式分析CD34+細

11、胞及CD34+CD49f+細胞絕對數(shù)及比例，得到合適的化合物濃度。通過體外造血功能實驗CFC(細胞集落形成實驗，colonyforming cell assay)驗證其對HSCs自我更新及多向分化兩大方面的影響。
　　結(jié)果:初步篩選85種抗氧化小分子化合物得到對CD34+細胞以及CD34+CD49f+細胞均有顯著作用(P＜0.05)的9種化合物，分別為C2968(5μM)、B1753(20μM)、B3358(10μM)、C0168

12、(10μM)、D3331（5μM）、B8071（20μM）、B8174(10μM)、C0263(20μM)、C2943（10μM）。綜合化合物濃度及擴增效果兩方面因素選取C2968(5μM)、B1753（20μM）、B3358(10μM)、C0168（10μM）、D3331(5μM)五種小分子化合物進行濃度梯度實驗，確定使用濃度。細胞集落形成實驗CFC結(jié)果顯示化合物C2968(0.5μM)、B1753（1.5μM）、B3358（15μM

13、）、D3331(1.5μM)處理組較對照組而言，細胞的集落形成能力顯著增強(P＜0.05），化合物處理可維持各類血細胞的祖細胞多向分化潛能，特別是多能祖細胞的造血能力。
　　結(jié)論:抗氧化小分子化合物C2968(0.5μM)、B1753（1.5μM）、B3358(15μM)、D3331(1.5μM)具有較好的HSCs體外擴增效果，在維持HSCs自我更新的同時能夠保證其多向分化潛能不受影響。C2968（0.5μM）、B1753（1.5