當(dāng)歸多糖調(diào)控造血干細(xì)胞衰老的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 成體干細(xì)胞是維持組織穩(wěn)態(tài)的重要因素，并在機(jī)體衰老進(jìn)程中起關(guān)鍵作用。造血干細(xì)胞(hematopoietic Stem cells，HSCs)是干細(xì)胞研究領(lǐng)域中開展最早、技術(shù)最成熟、認(rèn)識最深入并且廣泛應(yīng)用于臨床的一種成體干細(xì)胞。衰老機(jī)體中造血系統(tǒng)基本成分雖然得以維持，但HSCs的功能和數(shù)量卻逐漸降低，將導(dǎo)致免疫功能衰退和多種老年性疾病的發(fā)生。
　　 當(dāng)歸多糖（angelica sinensis polysacc

2、haride，ASP）是從當(dāng)歸中分離、提取的藥用有效成分，具有促進(jìn)造血、抗輻射損傷、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用。目前，有關(guān)ASP能否延緩HSCs衰老及其作用機(jī)制尚不清楚。本研究將干細(xì)胞研究技術(shù)和祖國傳統(tǒng)的抗衰老醫(yī)學(xué)理論相結(jié)合，采用HSCs體外衰老模型的復(fù)制和X線照射致小鼠HSCs衰老等現(xiàn)代生物學(xué)的研究手段，分別從體外與體內(nèi)兩條途徑系統(tǒng)地探討ASP調(diào)控HSCs衰老的作用及其可能的生物學(xué)機(jī)制，旨為重新激活衰老HSCs及調(diào)控其靶向分化提供實驗依據(jù)

3、和理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.免疫磁珠分選技術(shù)（magnetic-activated cell sorting，MACS）分離、純化干細(xì)胞抗原-1(Sca-1+) HSCs，流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞分選純度，臺酚藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性。
　　 2.采用衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色、四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法、細(xì)胞周期分析、甲基纖維素半固

4、體培養(yǎng)等方法，觀察氧化低密度脂蛋白(oxidation lowdensity lipoprotein，ox-LDL)對Sca-1+HSCs衰老生物學(xué)特性的影響，以建立ox-LDL體外誘導(dǎo)Sca-1+HSCs衰老模型。
　　 3.ASP與ox-LDL共培養(yǎng)Sca-1+HSCs，采用SA-β-Gal染色、細(xì)胞周期分析及甲基纖維素半固體培養(yǎng)觀察衰老生物學(xué)指標(biāo)的變化;酶學(xué)比色法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液超氧化物歧化酶(superoxide di

5、smutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量;免疫熒光檢測Sca-1+HSCs內(nèi)活性氧(reactive oxygen specie，ROS)水平;熒光定量PCR及Western blot檢測Sca-1+HSCs衰老相關(guān)基因p16、p21mRNA及細(xì)胞周期調(diào)控蛋白P16、P21、CDK2、CDK4、cyclinD及cycl

6、inE表達(dá)的變化;Southern blot和TRAP-PCR檢測Sca-1+HSCs端粒長度與端粒酶活性，以闡明ox-LDL體外誘導(dǎo)Sca-1+HSCs衰老及ASP體外調(diào)控Sca-1+HSCs衰老的生物學(xué)機(jī)制。
　　 4.X線3.0Gy/8F全身均勻照射(total body irradiation，TBI)小鼠，采用SA-β-Gal染色、細(xì)胞周期分析、甲基纖維素半固體培養(yǎng)等方法，觀察X線TBI對小鼠對Sca-1+HSCs衰老

7、生物學(xué)特性的影響，以建立小鼠Sca-1+HSCs體內(nèi)衰老模型。
　　 5.小鼠X線3.0Gy/8F全身均勻照射期間給予ASP灌胃，采用SA-β-Gal染色、細(xì)胞周期分析及甲基纖維素半固體培養(yǎng)觀察衰老生物學(xué)指標(biāo)的變化;酶學(xué)比色法測定Sca-1+HSCs總抗氧化能力(totalanti-oxidant，T-AOC);免疫熒光檢測Sca-1+HSCs內(nèi)ROS水平;熒光定量PCR及Western blot檢測HSCs衰老相關(guān)基因p16、

8、p21mRNA及細(xì)胞周期調(diào)控蛋白P16、P21、CDK2、CDK6、cyclinD及cyclin E表達(dá)的變化;Southern blot和TRAP-PCR測定Sca-1+HSCs端粒長度與端粒酶活性，以闡明3.0Gy/8F的X線TBI體內(nèi)誘導(dǎo)Sca-1+HSCs衰老及ASP體內(nèi)調(diào)控Sca-1+HSCs衰老的生物學(xué)機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 1.MACS分離純化后Sca-1+細(xì)胞純度為(86.21±6.17)％，顯著高于

9、分離純化前Sca-1+細(xì)胞百分比為(11.45±1.87)％;臺盼藍(lán)染色法測定分選的Sca-1+HSCs活性為（93.65±4.54）％。表明分選的Sca-1+HSCs細(xì)胞有較高的純度和良好的活性。
　　 2.ox-LDL體外誘導(dǎo)Sca-1+HSCs呈現(xiàn)典型的衰老生物學(xué)表現(xiàn):SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞率明顯增加;增殖能力明顯減弱;G1期細(xì)胞比例顯著升高、S期細(xì)胞比例顯著減少;混合集落形成單位(colonyforming uni

10、t-mixture，CFU-Mix)數(shù)量顯著減少。ox-LDL可誘導(dǎo)衰老Sca-1+HSCs培養(yǎng)上清液SOD、GSH-Px活性下降及MDA含量升高;細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加;端粒長度縮短，端粒酶活性降低;p16、p21mRNA及蛋白表達(dá)增強(qiáng)，CDK4、cyclinD及cyclinE蛋白表達(dá)降低，而對CDK2蛋白表達(dá)無影響。
　　 3.ASP體外作用于衰老Sca-1+HSCs可降低其SA-β-gal染色陽性細(xì)胞率、G1期細(xì)胞比例及P1

11、6表達(dá);增加S期細(xì)胞比例及CDK4、cyclinD蛋白表達(dá);抑制端粒DNA損傷;而對CFU-Mix數(shù)量、ROS水平、細(xì)胞培養(yǎng)上清液SOD、GSH-Px活性與MDA含量、P21、CDK2、cyclinE蛋白表達(dá)及端粒酶活性均無明顯影響。
　　 4.X線3.0Gy/8F全身均勻照射誘導(dǎo)小鼠Sca-1+HSCs呈現(xiàn)典型的衰老生物學(xué)表現(xiàn):SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞率明顯增加;G1期細(xì)胞比例顯著升高，S期細(xì)胞比例顯著減少;CFU-Mix

12、數(shù)量顯著減少。3.0Gy/8F的X線可誘導(dǎo)衰老Sca-1+HSCs T-AOC下降，ROS水平增加;端粒長度縮短、端粒酶活性降低;p16、p21 mRNA及蛋白表達(dá)增強(qiáng)，CDK6、CyclinD及CyclinE蛋白表達(dá)降低，而對CDK2蛋白表達(dá)無影響。
　　 5.ASP體內(nèi)作用于衰老Sca-1+HSCs后可降低其SA-β-gal染色陽性細(xì)胞率下降及G1期細(xì)胞比例、增加S期細(xì)胞比例及CFU-Mix數(shù)量;增加細(xì)胞T-AOC、降低RO

13、S水平;抑制端粒DNA損傷，增強(qiáng)端粒酶活性;下調(diào)p16、p21mRNA及蛋白表達(dá)，上調(diào)CDK6、CyclinD及CyclinE蛋白表達(dá)，CDK2蛋白表達(dá)無顯著性變化。
　　 結(jié)論：
　　 1.MACS可有效分選小鼠Sca-1+HSCs，分離純化的Sca-1+HSCs純度較高，活性良好。
　　 2.ox-LDL可作為一種體外復(fù)制Sca-1+HSCs衰老模型的有效致衰劑。
　　 3.ASP體外作用可通過調(diào)節(jié)部