當(dāng)歸多糖調(diào)控骨髓基質(zhì)細(xì)胞衰老的機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞衰老是機(jī)體衰老的基礎(chǔ)，成體干細(xì)胞在機(jī)體衰老進(jìn)程中起關(guān)鍵作用。文獻(xiàn)報(bào)道生理性老年骨髓功能減退和腫瘤放化療所致病理性骨髓功能抑制其機(jī)制均與造血干細(xì)胞衰老相關(guān)。造血干細(xì)胞的自我更新及增殖分化受骨髓造血誘導(dǎo)微環(huán)境的調(diào)控，骨髓基質(zhì)細(xì)胞作為造血誘導(dǎo)微環(huán)境的核心成分，其生理功能與造血干細(xì)胞的生理狀態(tài)密切相關(guān)。但迄今為止鮮有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)生理性衰老以及腫瘤放化療引起骨髓造血微環(huán)境的衰老生物學(xué)改變；骨髓造血誘導(dǎo)微環(huán)境的衰老對(duì)造血干細(xì)胞衰老的影響及其機(jī)制

2、，目前也不甚清楚。本研究用D-半乳糖復(fù)制衰老大鼠模型，觀察衰老大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)變化；D-半乳糖體外誘導(dǎo)復(fù)制衰老骨髓基質(zhì)細(xì)胞模型，建立骨髓基質(zhì)細(xì)胞與造血細(xì)胞共培養(yǎng)體系，初步觀察衰老骨髓基質(zhì)細(xì)胞對(duì)造血細(xì)胞增殖分化的影響。
　　當(dāng)歸多糖（angelica sinensis polysaccharide，ASP）是從祖國(guó)傳統(tǒng)中藥當(dāng)歸中分離、提取的有效藥用成份，具有調(diào)控造血、抗輻射損傷、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用。既往研究表明ASP能促

3、進(jìn)正常造血，對(duì)造血細(xì)胞和造血基質(zhì)細(xì)胞均有正向調(diào)控作用。本研究通過(guò)體內(nèi)外衰老模型進(jìn)一步探討 ASP調(diào)控 BMSCs衰老的作用及其可能的生物學(xué)機(jī)制，為從骨髓微環(huán)境角度探討ASP調(diào)控造血細(xì)胞衰老提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.D-Gal誘導(dǎo)復(fù)制衰老大鼠模型，觀察BMSCs的衰老生物學(xué)變化及ASP調(diào)控BMSCs衰老的生物學(xué)作用:實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組：連續(xù)6w頸部皮下注射N(xiāo)S2mL/d；衰老模型組：連續(xù)6w頸部皮下注射D

4、-Gal120mg/（kg·d）；ASP組：連續(xù)6w頸部皮下注射N(xiāo)S2mL/d，第3w開(kāi)始，腹腔注射ASP200mg/（kg·d）；ASP治療衰老組：連續(xù)6w頸部皮下注射D-Gal120mg/（kg·d），第3w開(kāi)始，腹腔注射ASP200mg/（kg·d）。藥物注射完畢第2天，處死大鼠，全骨髓貼壁法培養(yǎng)BMSCs。采用CCK-8法、SA-β-Gal染色、細(xì)胞周期分析、Western Blotting觀察衰老生物學(xué)指標(biāo)的變化；酶學(xué)比色法測(cè)

5、定細(xì)胞培養(yǎng)上清液超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；免疫熒光檢測(cè)BMSCs內(nèi)活性氧（reactive oxygen specie，ROS）水平；ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中SCF、IL-6含量。
　　2.D-Gal復(fù)制BMSCs體外衰老模型，研究ASP調(diào)控BMSCs衰老的生物學(xué)機(jī)理：無(wú)菌條件下取大鼠脛股骨，制備全骨髓細(xì)胞懸液，體外培養(yǎng)BMSCs

6、至F3代，進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組：BMSCs常規(guī)培養(yǎng)96h；衰老組：常規(guī)培養(yǎng)體系中加入30mg/mL D-Gal，培養(yǎng)96h；ASP組：常規(guī)培養(yǎng)體系中加入100μg/mL ASP，培養(yǎng)96h；ASP治療衰老組：30mg/mL D-Gal作用BMSCs48h后，加入100μg/mL ASP繼續(xù)培養(yǎng)48h；ASP延緩衰老組：100μg/mL ASP培養(yǎng)48h后，加入30mg/mL D-Gal繼續(xù)培養(yǎng)48h。采用CCK-8法、

7、SA-β-Gal染色、細(xì)胞周期分析、Western Blotting觀察衰老生物學(xué)指標(biāo)的變化；酶學(xué)比色法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液SOD、MDA含量；免疫熒光檢測(cè)BMSCs內(nèi)ROS水平； ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中SCF、IL-1β及GM-CSF含量。
　　3.建立BMSCs與骨髓單個(gè)核細(xì)胞（bone marrow mononuclear cells，BMNCs）共培養(yǎng)模型，觀察ASP調(diào)控BMSCs衰老對(duì)造血細(xì)胞增殖分化的影響：同上制

8、備BMSCs飼養(yǎng)層，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、衰老組、ASP組、ASP抗衰老組。提取BMNCs，分別種植于各組飼養(yǎng)層上，與BMSCs共培養(yǎng)48h。采用CFU-Mix集落半固體培養(yǎng)、CCK-8法、流式細(xì)胞周期術(shù)觀察分析造血細(xì)胞增殖分化生物學(xué)指標(biāo)。
　　結(jié)果
　　1.衰老大鼠BMSCs增殖能力明顯降低；細(xì)胞周期阻滯于G1期；衰老細(xì)胞特異性SA-β-Gal染色陽(yáng)性率明顯增加；衰老相關(guān)蛋白P16、P21、P53表達(dá)明顯上調(diào)。BMSCs內(nèi)SOD

9、酶活性降低、MDA及ROS含量升高；細(xì)胞分泌SCF、IL-6減少。
　　2.與衰老大鼠BMSCs相比，體內(nèi)注射ASP，可降低衰老大鼠BMSCs SA-β-gal染色陽(yáng)性率；G1期細(xì)胞比例降低、S期細(xì)胞比例增加；衰老相關(guān)蛋白P16、P21、P53表達(dá)下調(diào)；胞內(nèi)SOD酶活力上升、MDA及ROS水平下降；細(xì)胞培養(yǎng)上清SCF、IL-6表達(dá)升高。
　　3.ASP體外作用衰老BMSCs，BMSCs增殖能力上升；細(xì)胞SA-β-gal染色陽(yáng)

10、性率降低；G1期細(xì)胞比例減少，S期細(xì)胞比例增加；P16、P21、P53蛋白表達(dá)減弱；ASP提高BMSCs的SOD酶活性，降低MDA、ROS含量。ASP促進(jìn)BMSCs分泌SCF、IL-1β及GM-CSF。
　　4.與衰老組BMSCs共培養(yǎng)的BMNCs增殖能力下降；細(xì)胞周期分布改變，S期細(xì)胞減少，G1期細(xì)胞增多；多向性造血祖細(xì)胞CFU-Mix集落形成數(shù)量顯著性降低；與ASP抗衰老組BMSCs共培養(yǎng)的BMNCs增殖能力較與衰老組BMSC

11、s共培養(yǎng)的BMNCs明顯上升；S期細(xì)胞比例升高，G1期細(xì)胞比例下降；CFU-Mix集落形成數(shù)量上升。
　　結(jié)論
　　1.衰老大鼠BMSCs發(fā)生衰老生物學(xué)改變。
　　2.ASP可延緩衰老大鼠BMSCs衰老。
　　3.ASP延緩BMSCs衰老機(jī)制可能與ASP提高骨髓基質(zhì)細(xì)胞抗氧化能力，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，抑制衰老相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。
　　4.ASP通過(guò)延緩BMSCs衰老促進(jìn)造血細(xì)胞增殖分化，其機(jī)制可能與ASP降