當(dāng)歸補(bǔ)血湯調(diào)控紅系祖細(xì)胞分化的機(jī)制.pdf

1、背景和目的：
　　臨床治療紅細(xì)胞減少可以通過紅細(xì)胞回輸?shù)姆椒▉砘謴?fù)血液中紅細(xì)胞的數(shù)量，但伴有病毒和細(xì)菌感染的危險(xiǎn);可以通過靜脈補(bǔ)鐵來治療與缺鐵相關(guān)的貧血，但可能會(huì)引起惡心、面部潮紅、低血壓和過敏反應(yīng)等副作用，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致死亡;也可以通過促紅細(xì)胞生成素(EPO)來促進(jìn)機(jī)體自身紅細(xì)胞的生成，但是多達(dá)10％的貧血病人會(huì)因體內(nèi)產(chǎn)生EPO中和抗體或其它原因而導(dǎo)致治療失敗。EPO作為控制體內(nèi)紅細(xì)胞水平的主要細(xì)胞因子只是在CFU-E祖細(xì)胞分化為

2、成熟紅細(xì)胞的前期階段起調(diào)控作用，而且體內(nèi)CFU-E祖細(xì)胞的數(shù)量限制了EPO促進(jìn)紅細(xì)胞生成的能力。因此單純利用EPO治療紅細(xì)胞減少，只能調(diào)控紅細(xì)胞生成的某一環(huán)節(jié)，不能從根本上對紅細(xì)胞的生成進(jìn)行有效調(diào)控，同時(shí)CFU-E的消耗也會(huì)導(dǎo)致BFU-E祖細(xì)胞的消耗，從而導(dǎo)致BFU-E祖細(xì)胞庫的衰竭，繼而影響機(jī)體的后續(xù)造血，已有文獻(xiàn)報(bào)道用EPO治療后會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的純紅細(xì)胞再生障礙。因此開發(fā)給藥方便的、多靶點(diǎn)整體調(diào)節(jié)的，同時(shí)又安全有效的促紅細(xì)胞生成藥物是有

3、必要的。
　　本項(xiàng)目研究的中藥組方當(dāng)歸補(bǔ)血湯，出自金元四大家之一李杲的《內(nèi)外傷辨惑論》卷中，方劑組成為黃芪一兩，當(dāng)歸兩錢，具有補(bǔ)氣生血之功效，主治勞倦內(nèi)傷，氣血虛弱，陽浮于外，肌膚燥熱，面紅目赤，煩渴引飲，脈洪大而虛，以及婦人經(jīng)行、產(chǎn)后血虛發(fā)熱頭痛，或瘡瘍潰后久不愈合者。已有800多年的應(yīng)用歷史，臨床療效顯著，特別是對放化療引起的骨髓抑制有很好的緩解作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)歸補(bǔ)血湯能夠升高外周血中紅細(xì)胞和骨髓組織中BFU-E和CFU

4、-E祖細(xì)胞的數(shù)量。
　　內(nèi)容和結(jié)論：
　　第一部分當(dāng)歸補(bǔ)血湯質(zhì)控方法建立
　　1、當(dāng)歸補(bǔ)血湯HPLC色譜條件優(yōu)化
　　2、當(dāng)歸補(bǔ)血湯HPLC色譜條件方法學(xué)驗(yàn)證
　　3、當(dāng)歸補(bǔ)血湯中阿魏酸和芒柄花素含量測定
　　4、當(dāng)歸補(bǔ)血湯共有指紋圖譜和共有峰研究
　　主要結(jié)論:
　　不同溶劑溶解樣品所得色譜峰的數(shù)目和分離度不同，95％甲醇用來溶解樣品時(shí)，所得色譜峰的數(shù)目多于其它兩種，色譜峰的總峰面積也最

5、高，但通過分析色譜峰的峰形發(fā)現(xiàn)，親水區(qū)95％甲醇所獲得峰形都比較寬、平且伴有肩峰，峰的對稱性和分離度相比另外兩種較差，疏水區(qū)5％和50％甲醇所獲得峰的峰高低于95％，其中5％所獲得峰數(shù)目較少，峰的峰高較50％和95％低很多，有可能影響峰的檢出。建立色譜條件的目的是使更多的化合物能夠被檢出，因此選擇50％甲醇作為溶解樣品的溶劑。
　　色譜柱對中藥組分的分離有影響，其中Agilent TC-C18色譜柱所得色譜圖對應(yīng)色譜峰的保留時(shí)間較

6、另外兩種色譜柱時(shí)間延后，并且親水性藥物組分的分離效果顯著好于其它兩種色譜柱。疏水性藥物組分的分離效果三種色譜柱都能做到基線分離。綜合以上分析，Agilent TC-C18色譜柱的分離效果最好。
　　不同流動(dòng)相的分離能力也有所不同，乙腈洗脫能力強(qiáng)于甲醇，色譜峰出峰時(shí)間較快，保留時(shí)間較短。甲醇乙酸洗脫系統(tǒng)與其它三種洗脫系統(tǒng)相比色譜圖Ⅱ區(qū)峰數(shù)量較多，分離度較高，峰的對稱性較好;Ⅲ區(qū)色譜峰乙腈洗脫系統(tǒng)的分離效果較甲醇系統(tǒng)好，但從峰的數(shù)目和

7、能否做到基線分離來看，甲醇系統(tǒng)也可以做到基線分離，只是分離度沒有乙腈系統(tǒng)高。綜合以上分析，我們選擇甲醇乙酸系統(tǒng)作為進(jìn)一步優(yōu)化的流動(dòng)相。
　　由于流動(dòng)相洗脫能力的不同，不同分析物解吸附的時(shí)間就有所不同，從而導(dǎo)致峰與峰之間分離度不同。因此我們根據(jù)不同階段峰分離度的不同，采取了不同梯度的洗脫方法來達(dá)到最佳的分離效果。最終通過實(shí)驗(yàn)取得了良好的色譜峰分離度和基線分離。
　　為了達(dá)到控制產(chǎn)品質(zhì)量的目的，所采取的分析方法必須具有很高的準(zhǔn)確

8、性和可靠性，因此需要對所采取方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明不同時(shí)間點(diǎn)所得色譜指紋圖譜與其所得共有模式圖譜的相似度，均大于0.950，各色譜峰保留時(shí)間的RSD均小于0.3％，相對峰高比值的RSD除6和11號峰外（6號6.42％，11號5.09％）均小于5％，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定;精密度試驗(yàn)表明6次所得色譜指紋圖譜與其所得共有模式圖譜的相似度，均大于0.950，各色譜峰保留時(shí)間的RSD均小于0.8％，相對峰高比值的RSD均小于

9、5％，結(jié)果表明精密度良好;重復(fù)性試驗(yàn)表明6份供試品所得指紋圖譜與其所得共有模式圖譜的相似度，均大于0.99，各色譜峰保留時(shí)間的RSD均小于1.5‰相對峰高比值的RSD均小于5％，結(jié)果表明重復(fù)性良好。
　　通過比較6批當(dāng)歸補(bǔ)血湯的指紋圖譜，共篩選出17個(gè)共有峰，共有峰的保留時(shí)間RSD均小于0.1％，因此標(biāo)定此17個(gè)峰為共有指紋峰。
　　第二部分當(dāng)歸補(bǔ)血湯調(diào)控紅系祖細(xì)胞分化機(jī)制
　　1、當(dāng)歸補(bǔ)血湯小鼠體內(nèi)促紅細(xì)胞生成能力及

10、作用靶點(diǎn)研究
　　2、體外細(xì)胞模型建立
　　3、當(dāng)歸補(bǔ)血湯促骨髓基質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增加機(jī)制
　　4、當(dāng)歸補(bǔ)血湯體外促紅系祖細(xì)胞分化機(jī)制
　　主要結(jié)論:
　　當(dāng)歸補(bǔ)血湯小鼠體內(nèi)能夠促進(jìn)紅細(xì)胞生成。單因素方差分析結(jié)果表明各組間紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)目差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.608，P＜0.001;F=6.391，P=0.001;F=3.067，P=0.028)，LSD多重比較表明，當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組與模型組

11、相比外周血中網(wǎng)織紅細(xì)胞的數(shù)目顯著升高(P＜0.05)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯組外周血中紅細(xì)胞數(shù)目與模型組相比無顯著性差異。因此得出結(jié)論，當(dāng)歸補(bǔ)血湯在小鼠體內(nèi)能夠促進(jìn)網(wǎng)織紅細(xì)胞的生成，但對外周血中紅細(xì)胞的數(shù)目影響不大，這可能與外周血中成熟紅細(xì)胞的生命周期有關(guān)。
　　集落形成單位培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)單因素方差分析結(jié)果表明各組間CFU-E和BFU-E克隆數(shù)目差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.119，P＜0.001;F=9.346，P＜0.001)，LSD多重比較表

12、明當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量組和高劑量組骨髓中晚期紅系祖細(xì)胞的數(shù)目與模型組相比顯著升高(P＜0.01)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量組和高劑量組骨髓中早期紅系祖細(xì)胞的數(shù)目與模型組相比顯著升高(P＜0.01)。流式結(jié)果表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯中、高劑量組骨髓中紅系相關(guān)細(xì)胞百分比與模型組相比顯著性升高(P＜0.01)。以上結(jié)果表明，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可通過促進(jìn)紅系祖細(xì)胞增殖和分化來促進(jìn)紅細(xì)胞的生成。
　　取不同組骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)，以觀察骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長狀態(tài)。結(jié)果表明，第三

13、天時(shí)各組都有細(xì)胞開始貼壁生長，其中當(dāng)歸補(bǔ)血湯低、中、高劑量組和正常組較為顯著，貼壁生長細(xì)胞約鋪滿96孔板底的四分之一，而骨髓抑制模型組貼壁細(xì)胞細(xì)胞數(shù)目較少;第六天時(shí)當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組貼壁細(xì)胞己鋪板板底的二分之一;培養(yǎng)第九天當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組有明顯的成纖維細(xì)胞克隆形成。
　　細(xì)胞周期結(jié)果表明，當(dāng)歸補(bǔ)血湯低、中和高劑量組G2M期細(xì)胞比例分別為8％、7.4％和7.6％，與模型組相比P＞0.05，無顯著差異。細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)歸補(bǔ)血湯中

14、劑量和高劑量組聚集細(xì)胞的數(shù)目與模型組相比顯著著升高，具有顯著差異(P＜0.05)。通過以上動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測當(dāng)歸補(bǔ)血湯調(diào)控紅系祖細(xì)胞分化為成熟紅細(xì)胞的途徑之一，可能是通過增加骨髓基質(zhì)細(xì)胞與紅系祖細(xì)胞之間的相互接觸，并傳遞促紅系祖細(xì)胞向成熟紅細(xì)胞分化的細(xì)胞信號來完成。
　　骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)受到細(xì)胞接種密度和培養(yǎng)體系體積的影響。接種1×105個(gè)/孔的培養(yǎng)孔基本無骨髓基質(zhì)細(xì)胞生長，接種3×105個(gè)/孔細(xì)胞的骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁約30％左

15、右，接種5×105個(gè)/孔細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞貼壁達(dá)90％左右。3×105個(gè)/孔體系組，150μL和200μL培養(yǎng)體系孔骨髓基質(zhì)細(xì)胞的貼壁數(shù)目顯著低于100μL體系孔(P＜0.01)，而接種細(xì)胞數(shù)目為5×105個(gè)/孔時(shí)，各培養(yǎng)體系組骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁數(shù)目無顯著差異。當(dāng)細(xì)胞接種密度為3×105個(gè)/孔時(shí)，條件培養(yǎng)基組與普通培養(yǎng)基組相比能顯著促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長(P＜0.05)，而細(xì)胞接種數(shù)目為5×105個(gè)/孔時(shí)，條件培養(yǎng)基組細(xì)胞貼壁數(shù)目與普通培養(yǎng)基

16、組無顯著差異。結(jié)果提示我們條件培養(yǎng)基包含有促骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外生長所必須的生長因子，因此骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)自身會(huì)分泌胞外因子來促進(jìn)自身的生長，并且當(dāng)胞外因子的濃度達(dá)到一定濃度后促生長作用達(dá)到平臺(tái)，同時(shí)提示我們可以通過利用條件培養(yǎng)基來進(jìn)行骨髓基質(zhì)細(xì)胞的體外低密度培養(yǎng)。
　　第三部分當(dāng)歸補(bǔ)血湯調(diào)控紅系祖細(xì)胞分化的物質(zhì)基礎(chǔ)
　　1、不同批次當(dāng)歸補(bǔ)血湯的藥效學(xué)作用
　　2、不同批次當(dāng)歸補(bǔ)血湯藥效作用與指紋圖譜之間的譜效關(guān)系

17、
　　主要結(jié)論:
　　不同批次當(dāng)歸補(bǔ)血湯促骨髓基質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增加的能力有所不同，其中GG組當(dāng)歸補(bǔ)血湯促骨髓基質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增加的能力顯著強(qiáng)于其它組(P＜0.05)。通過直觀比較法和相關(guān)系數(shù)法探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯指紋圖譜與藥效學(xué)之間的譜效關(guān)系。通過比較GG組當(dāng)歸補(bǔ)血湯指紋圖譜與其它組指紋圖譜的差異，尋找在GG組峰面積最高的特征峰作為當(dāng)歸補(bǔ)血湯潛在的物質(zhì)基礎(chǔ)。又進(jìn)一步通過統(tǒng)計(jì)軟件分析了各色譜峰峰面積與藥效之間的相關(guān)性，以尋找當(dāng)歸補(bǔ)血湯發(fā)揮藥