microRNA126調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞多向分化的實驗研究.pdf

1、背景與目的：
　　內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)在血管內(nèi)皮受損時，由骨髓動員至外周血，可分化為新生單層內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而修復(fù)損傷的內(nèi)皮。但多項研究發(fā)現(xiàn)EPCs能發(fā)生內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EndMT):在TGF-β1的誘導(dǎo)下，失去KDR+、CD34+、VEGF等血管內(nèi)皮分子標(biāo)記，轉(zhuǎn)而表達(dá)α-SMA、SM22α、myocardin等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，使EPCs在治療動脈粥樣硬化性疾病中的價值受到質(zhì)疑。
　　microRNA126(miR-126)是

2、在內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)的一種促血管新生microRNA。miR-126能促進(jìn)EPCs的動員、遷移、增殖，不影響EPCs的內(nèi)皮分化，但miR-126對EPCs問質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響國內(nèi)外未見報道。
　　本研究擬觀察miR-126對EPCs間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制，為EPCs在動脈粥樣硬化治療中的作用進(jìn)一步提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　采用密度梯度離心法分離大鼠骨髓單個核細(xì)胞后通過離體擴(kuò)增培養(yǎng)法獲得骨髓源EPCs。于倒置相差顯微

3、鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況。免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)及乙?；兔芏戎鞍?DiI-Ac-LDL)和FITC標(biāo)記的荊豆凝集素1(FITC-UEA-1)雙熒光染色等方法鑒定EPCs純度。TGF-β1（5 ng/ml培養(yǎng)基）作用EPCs7天誘導(dǎo)EPCs的間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EndMT)。慢病毒轉(zhuǎn)染建立miR-126過表達(dá)EPCs。采用MTT方法檢測細(xì)胞活力;細(xì)胞損傷及Transwell方法檢測細(xì)胞遷移能力。慢病毒轉(zhuǎn)染建立PIK3R2基因的沉默及過表達(dá)EPC

4、s。通過熒光素酶報告系統(tǒng)確定PIK3R2是否為miR-126靶基因。FoxO3 shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染沉默F(xiàn)oxO3基因。采用Real-time PCR檢測間質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)水平。采用Western-blot檢測信號分子蛋白表達(dá)。研究miR-126對EPCs EndMT的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1、TGF-β1可成功誘導(dǎo)EPCs EndMT，其miR-126表達(dá)逐漸降低，呈時間依賴性。miR-126過表達(dá)不影

5、響EPCs的生長，但抑制間質(zhì)轉(zhuǎn)化后EPCs的增殖與遷移。
　　2、miR-126抑制EPCs間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物（α-SMA、SM22α、 myocardin）及間質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子(slug、snail、zeb1、endothelin-1)的表達(dá)，維持EPCs祖細(xì)胞標(biāo)記(CD34、CD31、CD133、KDR)及成熟內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物（VEGF、eNOS、iNOS、Flt-1）的表達(dá)。
　　3、熒光素酶質(zhì)粒報告系統(tǒng)確定PIK3R2在EPCs

6、內(nèi)為miR-126的一個靶基因。PIK3R2 shRNA能抑制EPCs向間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變及間質(zhì)標(biāo)記物(α-SMA、SM22α)的表達(dá)。
　　4、miR-126抑制EPCs內(nèi)SM22α的表達(dá);PIK3R2 cDNA轉(zhuǎn)染可增加EPCs胞漿內(nèi)PIK3R2的表達(dá)，同時能逆轉(zhuǎn)miR-126對TGFβ1作用下EPCs胞漿內(nèi)PIK3R2及SM22α表達(dá)的抑制。
　　5、EPCs問質(zhì)轉(zhuǎn)化后細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-FoxO3表達(dá)降低，而

7、Smad3、p-Smad3和Smad4表達(dá)無明顯變化，PIK3R2 shRNA抑制EPCs內(nèi)信號分子這種表達(dá)，PI3K抑制劑LY294002能逆轉(zhuǎn)PIK3R2 shRNA的作用。
　　6、通過IGF-1激活PI3K/Akt通路，能明顯增加EPCs內(nèi)p-FoxO3的表達(dá)，并抑制TGF-β1誘導(dǎo)的SM22α的表達(dá)。但對Smad3、p-Smad和Smad4表達(dá)無影響。
　　7、miR-126過表達(dá)能促進(jìn)PI3K、p-Akt、p-F

8、oxO3的表達(dá)，對p-Smad3、Smad4表達(dá)無明顯影響，并被PIK3R2 cDNA所逆轉(zhuǎn)。EPCs間質(zhì)轉(zhuǎn)化后Smad4，F(xiàn)oxO3核表達(dá)增多，miR-126抑制TGF-β1誘導(dǎo)下EPCs核內(nèi)Smad4和FoxO3的表達(dá)。
　　8、TGF-β1誘導(dǎo)EPCs間質(zhì)轉(zhuǎn)化后細(xì)胞p-FoxO3表達(dá)明顯降低，F(xiàn)oxO3 shRNA抑制EPCs中FoxO3的表達(dá);同時，F(xiàn)oxO3 shRNA抑制TGF-β1誘導(dǎo)的SM22α表達(dá)。
　　結(jié)