MicroRNA-126調(diào)控內(nèi)皮祖細胞功能在改善子癇前期胎盤血流灌注中的作用.pdf

1、本文分三個部分進行探討：
　　第一部分:miRNA-126及EPCs在子癇前期的發(fā)病機理的作用
　　目的:探究miR-126在子癇前期患者的臍血中內(nèi)皮祖細胞和胎盤的組織中的表達與胎盤的血管生成的作用。
　　方法:1.首先，分離和培養(yǎng)子癇前期組和對照組中臍血內(nèi)皮祖細胞，通過細胞形態(tài)學及免疫熒光染色（DiI-ac-LDL和FITC-UEA-I）檢測鑒定EPCs純度，并觀察記錄群落計數(shù)及群落直徑；
　　2.采用逆轉錄聚

2、合酶鏈反應檢測臍血EPCs及胎盤組織miRNA-126的表達；
　　3.采用相關性分析臍血EPCs及miRNA-126的表達；
　　4.采用免疫組織化學染色檢測胎盤組織血管密度。
　　結果:1.我們從分離和培養(yǎng)的單個核細胞，培養(yǎng)一周后發(fā)現(xiàn)細胞呈集落樣的分布，其中集落的中心為圓形細胞,在其周圍為紡錘形的細，此類型集落被稱為colony-forming units(CFUs)。熒光顯微鏡下細胞呈現(xiàn)FITC-UEA-I（綠色

3、熒光）和DiI-ac-LDL（紅色熒光）雙染色陽性，此時期的細胞為正在分化的早期EPC。子癇前期組臍靜脈血中EPCs數(shù)量（77±13）明顯低于正常孕婦組（136±23）；對照組臍血EPCs集落數(shù)量較子癇前期組明顯升高（8.7±2.2和4.3±1.3），且對照組CUFs群落直徑明顯高于子癇前期孕婦。
　　2.子癇前期臍血EPCs中miR-126表達量（0.55±0.36）明顯低于對照組（1.0±0.15）；子癇前期胎盤中miR-12

4、6表達量（0.38±0.22）明顯低于對照組（0.88±0.25）。
　　3.子癇前期組EPCs數(shù)量及miR-126表達水平呈現(xiàn)正相關（r=0.65,P<0.05）。對照組EPCs數(shù)量及miR-126表達水平無相關性。
　　4.子癇前期組孕婦胎盤的微血管數(shù)量（54.8±5.72）較正常組孕婦胎盤的微血管數(shù)量（77.6±7.92）顯著減少；臍血管S/D比值子癇前期組（3.78±0.95）明顯高于正常組（2.47±0.63）（p

5、均<0.05）。
　　結論:子癇前期患者臍血中EPCs數(shù)量及群落明顯減少，EPCs中miR-126表達下降可能與胎盤血管減少，子癇前期的發(fā)生密切相關。
　　第二部分:miR-126對EPCs功能及血管新生的調(diào)控作用
　　目的:研究上調(diào)了miRNA-126的表達對內(nèi)皮祖細胞增生、分化、運動和集落形成能力的影響，探究miRNA-126在內(nèi)皮祖細胞新生血管過程中的地位。
　　方法:1.分離、培養(yǎng)子癇前期患者臍血EPCs

6、，將細胞分為空白對照組（沒有進行過細胞轉染）、陰性對照組（轉染了mimic control）以及實驗組（轉染了miR-126 mimic）3組；
　　2.我們通過實時熒光定量PCR技術檢測miRNA-126的表達，了解轉染效率及過表達的效率；同時，采用PCR技術檢測miR-126下游基因PIK3R2和PI3K的mRNA表達水平。
　　3.采用免疫印跡技術檢測miR-126下游基因PIK3R2和PI3K蛋白的表達；
　　

7、4.采用MTT（3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）比色法測定轉染后的細胞活力；
　　5.我們通過重懸貼壁法探究進行過轉染的細胞的分化能力及集落形成能力
　　結果:1.轉染后miR-126 mimic的EPCs在熒光顯微鏡下可見強的紅色熒光，熒光陽性細胞占總細胞數(shù)的90％以上。對照組中無熒光表達。轉染后EPCs中miR-126的表達水平分別

8、為空白對照組miR-126（2.9±0.9）、陰性對照組3.8±2.2和實驗組7.5±1.8；
　　2.實驗組、空白對照組和陰性對照組下游基因PIK3R2的mRNA表達水平分別為1.0±0.32，1.34±0.29和0.25±0.28。下游基因PI3K的mRNA表達水平分別為0.46±0.22，0.54±0.27和0.85±0.23。下游基因的蛋白表達水平趨勢基本與mRNA的表達水平上是一致的。陰性對照組和空白對照組的比較，P>0

9、.05；陰性對照組和實驗組的比較，P<0.05。
　　3.轉染24小時后EPCs的細胞活力，實驗組的吸光度A值為（0.69±0.21），陰性對照組為（0.51±0.11），空白對照組為（0.49±0.13）。陰性對照組和空白對照組的比較，P>0.05；實驗組的A值與陰性對照組的比較，P<0.05。
　　4.24h后實驗組、空白對照組、陰性對照組遷移入Transwell小室下室的細胞總數(shù)分別為：141.3±1.9、84.2±2

10、.7和89.4±2.8個。實驗組要高于對照組，P<0.05。轉染miR-126能明顯增強EPCs的遷移能力。
　　5.細胞轉染一天后，計數(shù)的結果為梭形細胞，實驗組為（93.2±9.3）個，陰性對照組為（51.5±10.4）個，空白對照組為（45.5±10.7）。組間比較中，陰性對照組和空白對照組的比較，P>0.05；實驗組與陰性對照組P<0.05。
　　結論:miR-126表達水平的升高可以上調(diào)EPCs的增殖、遷移和分化能力

11、。
　　第三部分:局部轉染miRNA-126改善子癇前期大鼠胎盤灌注
　　目的:通過agomir-126局部轉染模型大鼠胎盤，觀察轉染agomir-126后胎盤的形態(tài)和毛細血管的密度等方面的改變，探究miRNA-126在改善孕鼠胎盤中血管新生中可能的作用和機理。
　　方法:1.通過L-NAME建立高血壓孕鼠模型；
　　2.然后對做好的模型鼠進行分組，使用胎盤局部注射轉染技術將agomir-126轉染到懷孕的鼠胎盤

12、組織中；
　　3.我們在轉染后的懷孕的鼠組織中進行冰凍切片，通過熒光顯微鏡觀察agomir-126表達以及了解的轉染效果；
　　4.通過使用超聲微泡技術動態(tài)的測量孕20day鼠胎盤中的血流灌注情況；
　　5.最后處死實驗鼠，測量實驗鼠的胎盤、胎鼠的形態(tài)、重量和外觀特點；
　　6.通過RT-PCR檢查轉染后孕鼠胎盤組織miR-126的表達水平；
　　7.通過CD31標記的免疫組織化學測定懷孕21day大鼠轉染

13、后的胎盤血管情況。
　　結果:1.本次實驗選取的21只懷孕大鼠，其中出現(xiàn)早產(chǎn)1只，發(fā)生麻醉及感染死亡1只；其余孕鼠均存活，于妊娠第21天剖腹取胎。
　　2.轉染后胎盤組織的冰凍切片在熒光下可見紅色的Cy3大面積出現(xiàn)了非常高的表達，體內(nèi)轉染效果也非常的好。
　　3.孕D15子癇組和治療組血壓均高于對照組（p<0.05）；D20時子癇組的血壓高于對照組和治療組，子癇組和治療組間差異無顯著性（p>0.05）。
　　4.

14、超聲微泡實時胎盤造影可清楚顯示胎盤的大小，直徑以及血流灌注情況。二維常規(guī)超聲下測量三組胎盤最大切面的面積，子癇組的切面面積明顯小于其它兩組，且超聲微泡造影下第8秒圖像顯示子癇組的充盈程度明顯低于其它兩組。大鼠胎盤的時間－強度曲線顯示子癇組的到達時間（AT）和達峰時間(TTP)均晚于對照組和治療組(P＜0.05)，治療組曲線與對照組較為一致，但到達時間（AT）略晚于對照組。
　　5.體內(nèi)轉染后，三組的胎鼠重量（g）分別為：對照組5.

15、26±0.06,子癇組4.15±0.08，治療組5.04±0.11；三組的胎盤重量（g）分別為：對照組0.60±0.03,子癇組0.43±0.02，治療組0.52±0.04；三組的胎盤直徑(cm)分別為：對照組1.43±0.14，子癇組1.25±0.18，治療組1.40±0.11。子癇組的胎盤胎鼠明顯小于其它兩組，且子癇組的胎盤外觀較其它兩組胎盤蒼白。治療組與子癇組相比較，胎鼠重量和胎盤重量差異具有統(tǒng)計學意義和胎鼠重量（p<0.05）。

16、
　　6.轉染后各組胎盤中 miR-126的表達水平，治療組為4.2±0.31，對照組為1.0±0.27，子癇組為0.693±0.21。各組分別比較，治療組與對照組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；對照組與子癇組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　7.對照組和治療組的絨毛間質(zhì)疏松，CD34染色陽性率高；子癇組的絨毛間質(zhì)稍密，CD34表達降低(×200)。治療組孕鼠胎盤的微血管數(shù)量（69.2±4.15）較子癇組（39.1±