氯丙咪嗪調(diào)控神經(jīng)干-祖細(xì)胞增殖和分化的分子機(jī)制.pdf

1、抑郁癥是全球性嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一。抑郁癥的發(fā)病率逐年遞增，已上升到全球普通疾病前10位。而其10％～15％的高自殺率已引起人們的高度重視。1994年美國(guó)國(guó)家疾病譜調(diào)查(NCS)結(jié)果表明，抑郁癥終身患病率為17.1％，男性為12.7％，女性為21.3％。美國(guó)于2003年進(jìn)行的再次疾病譜調(diào)查結(jié)果顯示：抑郁癥的終身患病率為16％。而在中國(guó)，尚無(wú)關(guān)于抑郁癥人群的最新統(tǒng)計(jì)數(shù)字，目前的統(tǒng)計(jì)數(shù)字來(lái)自1982年。據(jù)最保守的估計(jì)，目前中國(guó)內(nèi)地

2、抑郁癥發(fā)病率約為2.4％，即抑郁癥患者已超過(guò)2600萬(wàn)人。抑郁癥現(xiàn)狀的嚴(yán)峻，表明我們所生存的時(shí)代的心理健康狀況不容樂(lè)觀，同時(shí)也給世界各國(guó)的醫(yī)學(xué)專家、科研人員和政府機(jī)構(gòu)提出了迫切的要求：加強(qiáng)抑郁癥及抗抑郁治療的機(jī)制研究，提高防治和康復(fù)的水平。
　　 在機(jī)制研究方面：最經(jīng)典的是單胺類遞質(zhì)假說(shuō)，即5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NE)功能低下，這一論點(diǎn)成為抑郁癥機(jī)制研究的奠基石已逾50年。由此而發(fā)展起來(lái)的抗抑郁藥物：三環(huán)類抗抑郁

3、藥(TCAs)、5-HT重?cái)z取抑制劑(SSRIs)和單胺氧化酶抑制劑(MAOIs)等，至今為止仍為臨床一線抗抑郁藥。這些藥物在數(shù)十分鐘或者數(shù)小時(shí)內(nèi)即可顯著增加突觸間隙內(nèi)單胺類遞質(zhì)濃度，但是其發(fā)揮臨床療效，改善癥狀往往需要4-6周的時(shí)間。對(duì)于這一臨床藥理學(xué)現(xiàn)象，到目前為止，許多針對(duì)單胺類遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體、受體的研究都未能滿意地予以解釋。
　　 近年來(lái)提出的神經(jīng)發(fā)生(neurogenesis)假說(shuō)使神經(jīng)科學(xué)研究者有希望更深入地闡明抗抑郁藥

4、起效遲緩的臨床藥理現(xiàn)象?？挂钟羲幷T導(dǎo)神經(jīng)干/祖細(xì)胞增殖、分化，進(jìn)而使新生神經(jīng)元整合進(jìn)入神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)所需的時(shí)間(2-4周)與臨床抗抑郁藥的起效延遲十分吻合[8]。科學(xué)家們推測(cè)抗抑郁藥治療可能通過(guò)誘導(dǎo)海馬新生神經(jīng)元的產(chǎn)生，促進(jìn)成年大腦邊緣皮層正常功能的恢復(fù)而發(fā)揮臨床療效。很多研究，包括本實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果表明--大多數(shù)抗抑郁藥物(TCAs，SSRIs等)呈現(xiàn)抗抑郁效果的同時(shí)可以顯著促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的恢復(fù)，局部放射性照射阻斷海馬顆粒細(xì)胞下區(qū)(SGZ)神

5、經(jīng)發(fā)生的同時(shí)也拮抗抗抑郁藥的抗抑郁效果。而且，只有在慢性持續(xù)給藥而非急性大劑量給藥情況下，抗抑郁藥物才能誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生，這與抗抑郁藥發(fā)揮臨床療效具有相同的時(shí)程性。此外，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生)具有抗抑郁效果。相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和海馬等邊緣皮層的信息聯(lián)系的受損和退變可能是抑郁癥發(fā)病的關(guān)鍵因素，而抗抑郁藥則很有可能通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生，誘導(dǎo)新生神經(jīng)元的產(chǎn)生，并促進(jìn)其遷移、分化、成熟，并與現(xiàn)有神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行整合，從而使受損的邊緣腦區(qū)的功能恢

6、復(fù)，達(dá)到治療效果。
　　 那么，抗抑郁藥究竟如何調(diào)控成年海馬的神經(jīng)發(fā)生呢?近年來(lái)，有科學(xué)家推測(cè)，抗抑郁藥調(diào)控成年海馬神經(jīng)發(fā)生可能是通過(guò)上調(diào)海馬SGZ區(qū)內(nèi)的5-HT濃度，繼而通過(guò)5-HT的受體，發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)/營(yíng)養(yǎng)作用，從而促進(jìn)海馬內(nèi)神經(jīng)發(fā)生的恢復(fù)。但是一直未能在在體的神經(jīng)干/祖細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)5-HT受體表達(dá)，同時(shí)，5-HT遞質(zhì)系統(tǒng)的纖維投射也僅到達(dá)了海馬齒狀回(DG)的海馬門的部位。并且到目前為止，無(wú)實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明5-HT能神經(jīng)纖維與海

7、馬SGZ區(qū)的神經(jīng)干/祖細(xì)胞有直接的突觸聯(lián)系，這些都使抗抑郁藥通過(guò)上調(diào)5-HT而間接調(diào)控神經(jīng)干/祖細(xì)胞這一假說(shuō)受到質(zhì)疑。此外，上述各種抗抑郁藥作為一種小分子物質(zhì)，可以穿過(guò)血腦屏障，進(jìn)入任何一個(gè)腦區(qū)，包括擴(kuò)散入海馬內(nèi)的SGZ區(qū)，SGZ區(qū)又被認(rèn)為是海馬神經(jīng)發(fā)生微環(huán)境(the Neurogenic Niche)。那么，這類小分子藥物是否可以發(fā)揮直接作用，直接調(diào)控神經(jīng)干/祖細(xì)胞的增殖、遷移、分化、成熟等步驟?已有一些離體實(shí)驗(yàn)表明SSRIs及三環(huán)類

8、抗抑郁藥對(duì)神經(jīng)干/祖細(xì)胞具有直接促增殖、促分化作用。但是，真正要確認(rèn)抗抑郁藥對(duì)神經(jīng)干/祖細(xì)胞的直接調(diào)控作用，還需進(jìn)一步的深入研究。而抗抑郁藥對(duì)神經(jīng)干/祖細(xì)胞直接調(diào)控作用能得到確認(rèn)之后，這一調(diào)控作用的胞內(nèi)分子機(jī)制的特點(diǎn)則將成為下一步研究的重點(diǎn)。
　　 根據(jù)我們前期在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得出的結(jié)果：三環(huán)類抗抑郁藥在多種抑郁癥動(dòng)物模型中都具有良好的抗抑郁作用，而且，在慢性不可預(yù)知的復(fù)合刺激誘導(dǎo)的抑郁癥大鼠模型中，氯丙咪嗪不但具有良好的抗抑郁作用

9、同時(shí)顯著恢復(fù)由于應(yīng)激刺激而抑制的海馬的神經(jīng)發(fā)生，促進(jìn)新生神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)生。因此，本篇論文選用氯丙咪嗪進(jìn)行離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，是為了進(jìn)一步闡明抗抑郁藥調(diào)控神經(jīng)發(fā)生的相關(guān)胞內(nèi)分子機(jī)制。同時(shí)闡明氯丙咪嗪調(diào)控神經(jīng)干/祖細(xì)胞增殖或分化的胞內(nèi)信號(hào)分子也將為進(jìn)一步尋找新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。越來(lái)越多的研究關(guān)注調(diào)控神經(jīng)發(fā)生的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路。例如cAMP-CREB信號(hào)通路可能參與調(diào)控新生神經(jīng)元的存活。因?yàn)榧せ頲AMP-CREB信號(hào)通路可以增加海馬內(nèi)BDNF

10、的表達(dá)，繼而增加成年腦內(nèi)的神經(jīng)發(fā)生。這有可能是抑郁癥或抗抑郁治療影響海馬神經(jīng)發(fā)生的途徑之一?，F(xiàn)有結(jié)果暗示CREB可能是多種抗抑郁藥物的作用匯聚點(diǎn)。但是到目前為止這一假說(shuō)仍然只有極少量的研究支持。我們的研究可能為這方面的研究增加新的證據(jù)。此外，這一信號(hào)通路的激活引起的下游靶基因的變化也是本研究的另一靶點(diǎn)。
　　 總之，揭示抗抑郁藥調(diào)控海馬神經(jīng)發(fā)生的分子機(jī)制，將為深入闡明其治病機(jī)理及抑郁癥發(fā)病機(jī)制提供新的突破點(diǎn)；也為尋求新治療靶點(diǎn)，

11、探索新治療方法開拓新思路，為提高臨床療效提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 本論文從兩個(gè)方面闡明抗抑郁藥調(diào)控海馬神經(jīng)干/祖細(xì)胞增殖、分化的分子機(jī)制。首先，在體外培養(yǎng)的神經(jīng)干/祖細(xì)胞系統(tǒng)中，觀察三環(huán)類抗抑郁藥氯丙咪嗪是否可以直接調(diào)控海馬神經(jīng)干/祖細(xì)胞：a)建立體外海馬神經(jīng)干/祖細(xì)胞培養(yǎng)體系；b)明確氯丙咪嗪對(duì)海馬神經(jīng)干/祖細(xì)胞的增殖、分化的作用；c)同時(shí)明確具有直接調(diào)控作用的氯丙咪嗪的最佳劑量；其次，進(jìn)一步通過(guò)分子生物學(xué)方法，探尋三環(huán)

12、類抗抑郁藥氯丙咪嗪直接調(diào)控成年海馬神經(jīng)干/祖細(xì)胞的胞內(nèi)分子機(jī)制：a)觀察胞內(nèi)信號(hào)分子在氯丙咪嗪調(diào)控神經(jīng)干/祖細(xì)胞增殖時(shí)的表達(dá)差異；b)利用工具藥調(diào)控胞內(nèi)信號(hào)分子磷酸化，繼而觀察對(duì)氯丙咪嗪調(diào)控神經(jīng)干/祖細(xì)胞分化、增殖作用的影響；c)利用基因表達(dá)芯片尋找相關(guān)信號(hào)分子下游的靶基因。
　　 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1)三環(huán)類抗抑郁藥氯丙咪嗪可以直接調(diào)控海馬神經(jīng)干/祖細(xì)胞a)建立穩(wěn)定的體外海馬神經(jīng)干/祖細(xì)胞培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)的海馬

13、神經(jīng)干/祖細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)環(huán)境中穩(wěn)定增殖，并且在撤除促有絲分裂因子后，貼壁分化，可以分化出神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞。
　　 b)明確氯丙咪嗪對(duì)海馬神經(jīng)干/祖細(xì)胞的增殖、分化的作用在bFGF/EGF存在情況下，氯丙咪嗪可以協(xié)同bFGF/EGF進(jìn)一步促進(jìn)海馬神經(jīng)干/祖細(xì)胞的增殖，而在分化培養(yǎng)基中，氯丙咪嗪具有促進(jìn)神經(jīng)干/祖細(xì)胞分化的作用，其中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化明顯增多。
　　 c)明確具有直接調(diào)控作用的氯丙咪嗪的最

14、佳劑量在觀察氯丙咪嗪的促分化和增殖作用時(shí)顯示，2μM和5μM的氯丙咪嗪具有明顯的促增殖和分化的作用，而20μM的氯丙咪嗪已經(jīng)明顯的抑制增殖和分化的作用2)明確三環(huán)類抗抑郁藥氯丙咪嗪直接調(diào)控成年海馬神經(jīng)干/祖細(xì)胞的胞內(nèi)分子機(jī)制a)胞內(nèi)信號(hào)分子在氯丙咪嗪調(diào)控干/祖細(xì)胞分化、增殖時(shí)的表達(dá)差異胞內(nèi)多條信號(hào)分子參與干/祖細(xì)胞增殖與分化過(guò)程，其中c-Srk，Rsk，ERK等信號(hào)分子可能參與了氯丙咪嗪調(diào)控神經(jīng)干/祖細(xì)胞的胞內(nèi)信息傳遞。
　　

15、b)利用工具藥調(diào)控胞內(nèi)信號(hào)分子對(duì)氯丙咪嗪調(diào)控神經(jīng)干/祖細(xì)胞增殖作用的影響根據(jù)胞內(nèi)信號(hào)分子的時(shí)程變化，在18h和42h分別給予p-ERK的抑制劑PD98059和U0126，發(fā)現(xiàn)可以部分拮抗氯丙咪嗪的促增殖作用。
　　 c)利用基因表達(dá)芯片尋找相關(guān)信號(hào)分子下游的靶基因通過(guò)神經(jīng)干細(xì)胞芯片檢測(cè)，在加有2μM的氯丙咪嗪的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的神經(jīng)干/祖細(xì)胞與對(duì)照的神經(jīng)干/祖細(xì)胞相比，GDNF的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)。此外，氯丙咪嗪促分化的作用可

16、能與靶基因Bone morphogenetic protein15，Bonemorphogenetic protein8a，GDNF，Pleiotrophin表達(dá)上調(diào)及Neuropilin1表達(dá)下調(diào)相關(guān)。
　　 綜上所述，本研究可獲得以下結(jié)論：
　　 1.氯丙咪嗪具有促進(jìn)海馬神經(jīng)干/祖細(xì)胞的增殖與分化的作用2.氯丙咪嗪可能通過(guò)調(diào)控胞內(nèi)信號(hào)分子ERK信號(hào)通路繼而促進(jìn)靶基因GDNF表達(dá)而起到促增殖的作用3.氯丙咪嗪發(fā)揮促分化