氯丙咪嗪調(diào)控神經(jīng)干-祖細(xì)胞增殖和分化的分子機(jī)制.pdf

1、抑郁癥是全球性嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一。抑郁癥的發(fā)病率逐年遞增，已上升到全球普通疾病前10位。而其10％～15％的高自殺率已引起人們的高度重視。1994年美國國家疾病譜調(diào)查(NCS)結(jié)果表明，抑郁癥終身患病率為17.1％，男性為12.7％，女性為21.3％。美國于2003年進(jìn)行的再次疾病譜調(diào)查結(jié)果顯示：抑郁癥的終身患病率為16％。而在中國，尚無關(guān)于抑郁癥人群的最新統(tǒng)計數(shù)字，目前的統(tǒng)計數(shù)字來自1982年。據(jù)最保守的估計，目前中國內(nèi)地

2、抑郁癥發(fā)病率約為2.4％，即抑郁癥患者已超過2600萬人。抑郁癥現(xiàn)狀的嚴(yán)峻，表明我們所生存的時代的心理健康狀況不容樂觀，同時也給世界各國的醫(yī)學(xué)專家、科研人員和政府機(jī)構(gòu)提出了迫切的要求：加強(qiáng)抑郁癥及抗抑郁治療的機(jī)制研究，提高防治和康復(fù)的水平。
　　 在機(jī)制研究方面：最經(jīng)典的是單胺類遞質(zhì)假說，即5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NE)功能低下，這一論點成為抑郁癥機(jī)制研究的奠基石已逾50年。由此而發(fā)展起來的抗抑郁藥物：三環(huán)類抗抑郁

3、藥(TCAs)、5-HT重攝取抑制劑(SSRIs)和單胺氧化酶抑制劑(MAOIs)等，至今為止仍為臨床一線抗抑郁藥。這些藥物在數(shù)十分鐘或者數(shù)小時內(nèi)即可顯著增加突觸間隙內(nèi)單胺類遞質(zhì)濃度，但是其發(fā)揮臨床療效，改善癥狀往往需要4-6周的時間。對于這一臨床藥理學(xué)現(xiàn)象，到目前為止，許多針對單胺類遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體、受體的研究都未能滿意地予以解釋。
　　 近年來提出的神經(jīng)發(fā)生(neurogenesis)假說使神經(jīng)科學(xué)研究者有希望更深入地闡明抗抑郁藥

4、起效遲緩的臨床藥理現(xiàn)象?？挂钟羲幷T導(dǎo)神經(jīng)干/祖細(xì)胞增殖、分化，進(jìn)而使新生神經(jīng)元整合進(jìn)入神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)所需的時間(2-4周)與臨床抗抑郁藥的起效延遲十分吻合[8]。科學(xué)家們推測抗抑郁藥治療可能通過誘導(dǎo)海馬新生神經(jīng)元的產(chǎn)生，促進(jìn)成年大腦邊緣皮層正常功能的恢復(fù)而發(fā)揮臨床療效。很多研究，包括本實驗室的研究結(jié)果表明--大多數(shù)抗抑郁藥物(TCAs，SSRIs等)呈現(xiàn)抗抑郁效果的同時可以顯著促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的恢復(fù)，局部放射性照射阻斷海馬顆粒細(xì)胞下區(qū)(SGZ)神

5、經(jīng)發(fā)生的同時也拮抗抗抑郁藥的抗抑郁效果。而且，只有在慢性持續(xù)給藥而非急性大劑量給藥情況下，抗抑郁藥物才能誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生，這與抗抑郁藥發(fā)揮臨床療效具有相同的時程性。此外，神經(jīng)營養(yǎng)因子(促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生)具有抗抑郁效果。相關(guān)實驗結(jié)果說明神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和海馬等邊緣皮層的信息聯(lián)系的受損和退變可能是抑郁癥發(fā)病的關(guān)鍵因素，而抗抑郁藥則很有可能通過促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生，誘導(dǎo)新生神經(jīng)元的產(chǎn)生，并促進(jìn)其遷移、分化、成熟，并與現(xiàn)有神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行整合，從而使受損的邊緣腦區(qū)的功能恢

6、復(fù)，達(dá)到治療效果。
　　 那么，抗抑郁藥究竟如何調(diào)控成年海馬的神經(jīng)發(fā)生呢?近年來，有科學(xué)家推測，抗抑郁藥調(diào)控成年海馬神經(jīng)發(fā)生可能是通過上調(diào)海馬SGZ區(qū)內(nèi)的5-HT濃度，繼而通過5-HT的受體，發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)/營養(yǎng)作用，從而促進(jìn)海馬內(nèi)神經(jīng)發(fā)生的恢復(fù)。但是一直未能在在體的神經(jīng)干/祖細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)5-HT受體表達(dá)，同時，5-HT遞質(zhì)系統(tǒng)的纖維投射也僅到達(dá)了海馬齒狀回(DG)的海馬門的部位。并且到目前為止，無實驗證據(jù)表明5-HT能神經(jīng)纖維與海

7、馬SGZ區(qū)的神經(jīng)干/祖細(xì)胞有直接的突觸聯(lián)系，這些都使抗抑郁藥通過上調(diào)5-HT而間接調(diào)控神經(jīng)干/祖細(xì)胞這一假說受到質(zhì)疑。此外，上述各種抗抑郁藥作為一種小分子物質(zhì)，可以穿過血腦屏障，進(jìn)入任何一個腦區(qū)，包括擴(kuò)散入海馬內(nèi)的SGZ區(qū)，SGZ區(qū)又被認(rèn)為是海馬神經(jīng)發(fā)生微環(huán)境(the Neurogenic Niche)。那么，這類小分子藥物是否可以發(fā)揮直接作用，直接調(diào)控神經(jīng)干/祖細(xì)胞的增殖、遷移、分化、成熟等步驟?已有一些離體實驗表明SSRIs及三環(huán)類

8、抗抑郁藥對神經(jīng)干/祖細(xì)胞具有直接促增殖、促分化作用。但是，真正要確認(rèn)抗抑郁藥對神經(jīng)干/祖細(xì)胞的直接調(diào)控作用，還需進(jìn)一步的深入研究。而抗抑郁藥對神經(jīng)干/祖細(xì)胞直接調(diào)控作用能得到確認(rèn)之后，這一調(diào)控作用的胞內(nèi)分子機(jī)制的特點則將成為下一步研究的重點。
　　 根據(jù)我們前期在動物實驗中得出的結(jié)果：三環(huán)類抗抑郁藥在多種抑郁癥動物模型中都具有良好的抗抑郁作用，而且，在慢性不可預(yù)知的復(fù)合刺激誘導(dǎo)的抑郁癥大鼠模型中，氯丙咪嗪不但具有良好的抗抑郁作用

9、同時顯著恢復(fù)由于應(yīng)激刺激而抑制的海馬的神經(jīng)發(fā)生，促進(jìn)新生神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)生。因此，本篇論文選用氯丙咪嗪進(jìn)行離體細(xì)胞實驗，是為了進(jìn)一步闡明抗抑郁藥調(diào)控神經(jīng)發(fā)生的相關(guān)胞內(nèi)分子機(jī)制。同時闡明氯丙咪嗪調(diào)控神經(jīng)干/祖細(xì)胞增殖或分化的胞內(nèi)信號分子也將為進(jìn)一步尋找新的治療靶點提供依據(jù)。越來越多的研究關(guān)注調(diào)控神經(jīng)發(fā)生的細(xì)胞內(nèi)信號通路。例如cAMP-CREB信號通路可能參與調(diào)控新生神經(jīng)元的存活。因為激活cAMP-CREB信號通路可以增加海馬內(nèi)BDNF

10、的表達(dá)，繼而增加成年腦內(nèi)的神經(jīng)發(fā)生。這有可能是抑郁癥或抗抑郁治療影響海馬神經(jīng)發(fā)生的途徑之一。現(xiàn)有結(jié)果暗示CREB可能是多種抗抑郁藥物的作用匯聚點。但是到目前為止這一假說仍然只有極少量的研究支持。我們的研究可能為這方面的研究增加新的證據(jù)。此外，這一信號通路的激活引起的下游靶基因的變化也是本研究的另一靶點。
　　 總之，揭示抗抑郁藥調(diào)控海馬神經(jīng)發(fā)生的分子機(jī)制，將為深入闡明其治病機(jī)理及抑郁癥發(fā)病機(jī)制提供新的突破點；也為尋求新治療靶點，

11、探索新治療方法開拓新思路，為提高臨床療效提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。
　　 本論文從兩個方面闡明抗抑郁藥調(diào)控海馬神經(jīng)干/祖細(xì)胞增殖、分化的分子機(jī)制。首先，在體外培養(yǎng)的神經(jīng)干/祖細(xì)胞系統(tǒng)中，觀察三環(huán)類抗抑郁藥氯丙咪嗪是否可以直接調(diào)控海馬神經(jīng)干/祖細(xì)胞：a)建立體外海馬神經(jīng)干/祖細(xì)胞培養(yǎng)體系；b)明確氯丙咪嗪對海馬神經(jīng)干/祖細(xì)胞的增殖、分化的作用；c)同時明確具有直接調(diào)控作用的氯丙咪嗪的最佳劑量；其次，進(jìn)一步通過分子生物學(xué)方法，探尋三環(huán)

12、類抗抑郁藥氯丙咪嗪直接調(diào)控成年海馬神經(jīng)干/祖細(xì)胞的胞內(nèi)分子機(jī)制：a)觀察胞內(nèi)信號分子在氯丙咪嗪調(diào)控神經(jīng)干/祖細(xì)胞增殖時的表達(dá)差異；b)利用工具藥調(diào)控胞內(nèi)信號分子磷酸化，繼而觀察對氯丙咪嗪調(diào)控神經(jīng)干/祖細(xì)胞分化、增殖作用的影響；c)利用基因表達(dá)芯片尋找相關(guān)信號分子下游的靶基因。
　　 主要實驗結(jié)果如下：
　　 1)三環(huán)類抗抑郁藥氯丙咪嗪可以直接調(diào)控海馬神經(jīng)干/祖細(xì)胞a)建立穩(wěn)定的體外海馬神經(jīng)干/祖細(xì)胞培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)的海馬

13、神經(jīng)干/祖細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)環(huán)境中穩(wěn)定增殖，并且在撤除促有絲分裂因子后，貼壁分化，可以分化出神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞。
　　 b)明確氯丙咪嗪對海馬神經(jīng)干/祖細(xì)胞的增殖、分化的作用在bFGF/EGF存在情況下，氯丙咪嗪可以協(xié)同bFGF/EGF進(jìn)一步促進(jìn)海馬神經(jīng)干/祖細(xì)胞的增殖，而在分化培養(yǎng)基中，氯丙咪嗪具有促進(jìn)神經(jīng)干/祖細(xì)胞分化的作用，其中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化明顯增多。
　　 c)明確具有直接調(diào)控作用的氯丙咪嗪的最

14、佳劑量在觀察氯丙咪嗪的促分化和增殖作用時顯示，2μM和5μM的氯丙咪嗪具有明顯的促增殖和分化的作用，而20μM的氯丙咪嗪已經(jīng)明顯的抑制增殖和分化的作用2)明確三環(huán)類抗抑郁藥氯丙咪嗪直接調(diào)控成年海馬神經(jīng)干/祖細(xì)胞的胞內(nèi)分子機(jī)制a)胞內(nèi)信號分子在氯丙咪嗪調(diào)控干/祖細(xì)胞分化、增殖時的表達(dá)差異胞內(nèi)多條信號分子參與干/祖細(xì)胞增殖與分化過程，其中c-Srk，Rsk，ERK等信號分子可能參與了氯丙咪嗪調(diào)控神經(jīng)干/祖細(xì)胞的胞內(nèi)信息傳遞。
　　

15、b)利用工具藥調(diào)控胞內(nèi)信號分子對氯丙咪嗪調(diào)控神經(jīng)干/祖細(xì)胞增殖作用的影響根據(jù)胞內(nèi)信號分子的時程變化，在18h和42h分別給予p-ERK的抑制劑PD98059和U0126，發(fā)現(xiàn)可以部分拮抗氯丙咪嗪的促增殖作用。
　　 c)利用基因表達(dá)芯片尋找相關(guān)信號分子下游的靶基因通過神經(jīng)干細(xì)胞芯片檢測，在加有2μM的氯丙咪嗪的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的神經(jīng)干/祖細(xì)胞與對照的神經(jīng)干/祖細(xì)胞相比，GDNF的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)。此外，氯丙咪嗪促分化的作用可

16、能與靶基因Bone morphogenetic protein15，Bonemorphogenetic protein8a，GDNF，Pleiotrophin表達(dá)上調(diào)及Neuropilin1表達(dá)下調(diào)相關(guān)。
　　 綜上所述，本研究可獲得以下結(jié)論：
　　 1.氯丙咪嗪具有促進(jìn)海馬神經(jīng)干/祖細(xì)胞的增殖與分化的作用2.氯丙咪嗪可能通過調(diào)控胞內(nèi)信號分子ERK信號通路繼而促進(jìn)靶基因GDNF表達(dá)而起到促增殖的作用3.氯丙咪嗪發(fā)揮促分化