異丙酚對肝細胞凋亡及神經(jīng)干細胞增殖的作用及其分子機制研究.pdf

1、第一部分異丙酚通過激活ERK信號通路減少H2O2引起的L02肝細胞凋亡
　　 目的:已有報道證明異丙酚在缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusionI/R)中對一些重要臟器具有保護作用,但是對肝細胞的作用報道甚少。此外,最近的研究顯示ERK信號通路在氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。因此我們用H2O2誘導L02人肝細胞氧化損傷,觀察異丙酚預處理對L02細胞的影響并且進一步檢測ERK通路在其中的作用。
　　 方法:①L0

2、2細胞經(jīng)異丙酚預處理后被H2O2誘導凋亡,用TUNEL法及Caspase-3切割程度來檢測細胞凋亡。②用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測ERK及MEK的磷酸化情況。③通過實時定量PCR技術(shù)檢測Bcl-2,Bcl-Xl,Bad和Bar的Mrna表達量變化。
　　 結(jié)果:在H2O2誘導的凋亡過程中,經(jīng)異丙酚預處理的L02細胞凋亡數(shù)量及Caspase-3切割量均明顯減少。并且這種減少與異丙酚的劑量成正相關(guān):當異丙酚劑量用至0.3mM時,細胞的凋亡程

3、度被降至最低。與此一致的是ERK的磷酸化被顯著激活。單用不同濃度的異丙酚(0.01-0.3mM)處理細胞,檢測到濃度依賴性的ERK及MEK磷酸化升高。不同時間點(0-4h)收獲經(jīng)異丙酚處理的細胞,發(fā)現(xiàn)ERK及MEK在0.5h內(nèi)就可以被激活,隨后逐漸降低,至4h時,ERK及MEK的活性下降到峰值時的一半。用特異性的MEK抑制劑PD98059處理細胞,完全抑制異丙酚誘導的ERK活性,并且加重了細胞的凋亡程度。異丙酚預處理減少了促凋亡基因Ba

4、d和Bax的Mrna表達,并且這種抑制作用可以被PD98059逆轉(zhuǎn)。
　　 結(jié)論:我們的研究提示異丙酚對H2O2誘導的人肝細胞凋亡具有保護作用,并且這種保護作用至少部分是通過激活ERK信號通路進而抑制Bad和Bax的表達起作用的。
　　 第二部分異丙酚激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵分子Grp78
　　 目的:我們第一部分研究發(fā)現(xiàn)異丙酚對過氧化氫引起的人肝細胞凋亡具有保護作用。但異丙酚如何調(diào)節(jié)ERK活性,ERK發(fā)揮作用的途徑有

5、哪些,目前尚不了解?，F(xiàn)有的一些文獻報道了氧化應(yīng)激可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而導致細胞凋亡,而ERK可以上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucoseregulatedprotein78,Grp78)的表達,Grp78對抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑的凋亡有著重要的作用。因此,我們分析異丙酚的作用是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān),即是否影響了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上特異性蛋白質(zhì)分子的表達。
　　 方法:用0.01-0.3mM異丙酚預處理L02人肝細胞,檢測異丙酚預處理對內(nèi)

6、質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子伴侶蛋白Grp78、Grp94、PDI及Calnexin表達的影響;構(gòu)建Grp78啟動子驅(qū)動的螢火蟲(Photinuspyralis)熒光素酶報告質(zhì)粒;Grp78啟動子驅(qū)動的螢火蟲熒光素酶質(zhì)粒與CMV啟動子驅(qū)動的海腎(Renillareniformis)熒光素酶質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染L02細胞,檢測不同濃度的異丙酚對Grp78啟動子活性的影響。
　　 結(jié)果:蛋白印跡檢測發(fā)現(xiàn)異丙酚處理后Grp78、Grp94及PDI的蛋白質(zhì)表

7、達水平均上調(diào),其中Grp78的表達增強尤為顯著;成功構(gòu)建了Grp78啟動子驅(qū)動的熒光素酶報告質(zhì)粒;熒光素酶活性測定結(jié)果顯示異丙酚上調(diào)Grp78啟動子驅(qū)動的熒光素酶活性。
　　 結(jié)論:我們的研究提示異丙酚可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激系統(tǒng)相關(guān)分子伴侶蛋白的表達,特別是顯著激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激系統(tǒng)上游的關(guān)鍵分子Grp78。啟動子活性測定發(fā)現(xiàn)異丙酚通過轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)從而最終增加了Grp78蛋白質(zhì)水平的表達。
　　 第三部分異丙酚抑制大鼠神經(jīng)干細

8、胞的體外增殖
　　 目的:麻醉藥對神經(jīng)系統(tǒng)有深遠的作用,而大部分研究都集中在對圍手術(shù)期認知功能的短暫階段評估。事實上,麻醉藥也影響了神經(jīng)前體細胞向神經(jīng)元發(fā)育這個過程。最近有報道內(nèi)源性神經(jīng)前體細胞在腦外傷后被激活,但自我修復的分子機制并不清楚。由于對細胞有抗缺血再灌注損傷的保護作用,異丙酚常被使用在神經(jīng)外科手術(shù)中,然而它在神經(jīng)前體細胞中的作用尚未被闡述。因此,我們以體外培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)干細胞為模型研究異丙酚對神經(jīng)干細胞增殖的影響。<

9、br>　　 方法:從孕14.5天胎鼠前腦分離培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細胞,細胞免疫熒光檢測神經(jīng)干細胞分化前后相關(guān)標志基因的表達;用0-0.05mM的異丙酚處理神經(jīng)干細胞,MTS及BrdU摻入法檢測細胞生長與增殖情況;流式細胞測定神經(jīng)干細胞的細胞周期分布情況;TUNEL法及PARP蛋白印跡檢測細胞的凋亡情況;RT-PCR檢測GABAA受體亞基的表達;蛋白印跡檢測蛋白激酶Chk1及Chk2的磷酸化激活情況。
　　 結(jié)果:成功分離并獲得單層貼

10、壁培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞,細胞免疫熒光證實細胞表達神經(jīng)干細胞的標志抗原蛋白巢蛋白(Nestin),在特定條件下可以分化為TuJ陽性的神經(jīng)元及GFAP陽性的星型膠質(zhì)細胞。MTS檢測顯示異丙酚抑制神經(jīng)干細胞的體外生長;BrdU摻入及細胞周期分析顯示異丙酚使細胞停滯在S期;TUNEL及PARP蛋白印跡測定顯示異丙酚并不導致凋亡;異丙酚增強Chk1-Ser317的磷酸化;GABAA受體特異性拮抗劑Bicuculline可以部分阻斷異丙酚的這些作用。<