NMDA受體及其亞單位在人胚腦神經(jīng)干細(xì)胞增殖、凋亡中作用的研究.pdf

1、目的:觀察NMDA受體亞單位1、2A、2B在早期培養(yǎng)的人胚腦神經(jīng)干細(xì)胞中的表達(dá)變化。使用一定劑量的NMDA初步探討NMDA受體對(duì)hNSCs凋亡、增殖的影響。籍以填補(bǔ)hNSCs生物學(xué)研究中有關(guān)NMDA受體發(fā)育和作用方面的空白。 方法: 1．從正常流產(chǎn)人10～12周胚胎海馬分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化、鑒定人胚腦神經(jīng)干細(xì)胞(Human neural stem cells，hNSCs)，血清誘導(dǎo)分化后，用Nestin、β-ⅢTubuli

2、n、GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)鑒定細(xì)胞性質(zhì)和類(lèi)型。 2．取原代、一代和二代處于指數(shù)生長(zhǎng)期的hNSCs，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)、RT-PCR和Western-blot等方法觀察NMDA受體亞單位1、2A、2B(N+Methyl-D-Aspartate receptor subunits 1、2A、2B，NR1、NR2A、NR2B)mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。 3．取傳代培養(yǎng)的hNSCs隨機(jī)分組：①正常組；②1μM NMDA組；

3、③10μMNMDA組；④30μM NMDA組；⑤100 μMNMDA組。每組取4孔，然后加入NMDA，放在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，3天換液。各組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，用Hoechst33258進(jìn)行熒光染色，計(jì)算出凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以觀察NMDA受體對(duì)hNSCs凋亡的影響。 4．取傳代培養(yǎng)的hNSCs隨機(jī)分組：①正常組；②1μMNMDA組；③10μMNMDA組；④30μMNMDA組；⑤100μ MNMDA組。每組取8孔，然后加入NMDA，放

4、在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，3天換液。各組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，用MTT法測(cè)定各孔光密度(OD)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以研究NMDA受體對(duì)hNSCs增殖的影響。 結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(mean±SD)，Western blot數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與一個(gè)對(duì)照組比較采用最小顯著差法(LSD)，實(shí)驗(yàn)組之間比較采用q檢驗(yàn)。凋亡率數(shù)據(jù)先用arcsin平方根P轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，然后行單因素方差分析。以

5、P<0.05表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異，P<0.01表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有極顯著差異。 結(jié)果: 1．培養(yǎng)的細(xì)胞Nestin反應(yīng)陽(yáng)性，加入血清誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞可以分別分化成β-ⅢTubulin、GFAP陽(yáng)性的細(xì)胞，表明分離培養(yǎng)的是hNSCs。 2．hNSCs在原代、一代和二代時(shí)，NMDA受體亞單位NR1、NR2A、NR2B免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)均呈陽(yáng)性，且肉眼觀察無(wú)明顯差別：RT-PCR結(jié)果提示三種亞單位在不同的時(shí)間點(diǎn)mRNA

6、皆穩(wěn)定表達(dá)；Western-blot結(jié)果顯示，三種亞單位在不同的時(shí)間點(diǎn)各自蛋白的表達(dá)量基本一致。 3．在3天、7天、12天時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡率與正常組相比無(wú)明顯差異。 4．在NMDA作用3天和7天時(shí)，100 μ M組的OD值與正常組相比出現(xiàn)明顯增加(p<0.05)，其它各組與正常組相比無(wú)明顯變化，而且各實(shí)驗(yàn)組間也無(wú)明顯變化。NMDA作甩12天時(shí)，30 μ M和100 μ M組的OD值與正常組相比均明顯增加(p<

7、0.05)，其它各組與正常組比較無(wú)明顯增加，而且30 μM和100 μM組間也無(wú)明顯差別。 結(jié)論: 1．從人胚腦海馬中分離出的神經(jīng)干細(xì)胞，在培養(yǎng)早期就有NMDA受體亞單位NR1、NR2A、NR2B的表達(dá)。 2．1 μ M、10 μ M、30 μ M和100 μ M的NMDA對(duì)hNSCs的凋亡無(wú)明顯影響，提示hNSCs對(duì)興奮性毒素有較好的耐受性。 3．30 μ M和100 μ M的NMDA使hNSGs/的M