NMDA受體亞單位1在缺血大鼠腦SVZ神經(jīng)干細(xì)胞上超微分布的研究.pdf

1、目的：研究NMDA受體亞單位1(N-methyl-D-aspartate receptor subunit1，NR1)在缺血大鼠腦室下區(qū)(subventricularzone，SVZ)神經(jīng)干細(xì)胞上的超微分布及表達(dá)變化，為NMDA受體亞單位1參與缺血再灌注損傷引起的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖提供形態(tài)學(xué)方面的依據(jù)。
　　方法：健康成年SD大鼠，體重220-250 g，隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組及腦缺血再灌注組，線栓法制作大腦中動(dòng)脈栓塞(Middl

2、e cerebral artery occlusion，MCAO)2小時(shí)再灌注模型，術(shù)后分1、3、7、14天4個(gè)時(shí)間點(diǎn)取腦，之后對(duì)正常組、假手術(shù)組及MCAO組大鼠分別進(jìn)行灌注固定，做150μm振動(dòng)切片，取含SVZ腦片，經(jīng)梯度蔗糖浸泡，液氮凍融處理后，室溫下兔血清封閉；分別通過(guò)Nestin免疫組織化學(xué)法標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞和免疫金一銀標(biāo)記顯示NR1，光鏡下拍照。之后取Nestin標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞腦片行免疫金一銀標(biāo)記顯示NR1，光鏡下拍照。分別取Ne

3、stin、NR1及Nestin/NR1雙標(biāo)記的腦片的陽(yáng)性部位，大小約1 mm3，經(jīng)系列脫水，置換，國(guó)產(chǎn)618樹(shù)脂浸潤(rùn)，包埋，聚合，修塊，做70 nm超薄切片，經(jīng)醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察、拍照。
　　用Image Pro圖像處理與分析系統(tǒng)進(jìn)行光鏡下圖像分析。電鏡組每組選取5張圖片，每張圖片選擇相同的面積進(jìn)行NR1計(jì)數(shù)。
　　結(jié)果：采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以X±s表示，組間比較采用單因素方差分析，多個(gè)

4、實(shí)驗(yàn)組之間比較采用最小顯著差法(LSD)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果1.光鏡下可見(jiàn)，各組大鼠SVZ均可見(jiàn)NR1陽(yáng)性細(xì)胞，假手術(shù)組陽(yáng)性細(xì)胞IOD值與正常組比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MCAO-組大鼠NR1的IOD值在缺血后1d開(kāi)始增加，7d達(dá)到高峰，14d恢復(fù)至3d水平；同樣我們可以發(fā)現(xiàn)Nestin免疫組化染色結(jié)果中各組大鼠SVZ均可見(jiàn)Nestin陽(yáng)性細(xì)胞，假手術(shù)組陽(yáng)性細(xì)胞IOD值與正常組比較差異沒(méi)有統(tǒng)

5、計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MCAO-組大鼠Nestin的IOD值在缺血后3d開(kāi)始增加，7d達(dá)到高峰，14d恢復(fù)至3d水平；Nestin/NR1免疫組化染色結(jié)果可見(jiàn)各組大鼠SVZ均有Nestin/NR1陽(yáng)性細(xì)胞，假手術(shù)組陽(yáng)性細(xì)胞IOD值與正常組比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MCAO-組大鼠Nestin/NR1的IOD值在缺血后1d開(kāi)始增加，7d達(dá)到高峰，14d恢復(fù)至3d水平；2.電鏡下可見(jiàn)NR1在缺血大鼠腦SVZ超微分布：通過(guò)透

6、射電鏡觀察，大鼠腦SVZ Nestin免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物呈黑色絮狀電子致密物，分布于Nestin免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿內(nèi)；NR1免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物呈黑色顆粒狀，分布于SVZ各型細(xì)胞的胞膜、胞漿以及高爾基體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)NR1免疫金顆粒與Nestin免疫組化產(chǎn)物共存。陰性對(duì)照樣本未見(jiàn)任何標(biāo)記。與正常組及假手術(shù)組比較可見(jiàn)腦缺血后SVZ神經(jīng)干細(xì)胞上胞漿內(nèi)NR1的顯著增多，且NR1表達(dá)在1天開(kāi)始增加，7天達(dá)高峰(P<0.05)；此時(shí)