靶向G-四鏈體的小分子化合物SYUIQ-5誘導腫瘤細胞自噬性死亡及其機制.pdf

1、研究背景與目的： 人端粒DNA由5’——3’重復序列和一個3’懸突端組成，富含鳥嘌呤重復序列的DNA鏈在一些小分子化合物的誘導下能夠形成G—四鏈體。 本文主要探討SYUIQ—5誘導腫瘤細胞發(fā)生自噬的分子機制及自噬在其抗腫瘤中的作用。 研究方法： 用MTT法檢測SYUIQ—5對腫瘤細胞的增殖抑制作用；免疫印跡法和RT—PCR法分別檢測蛋白和mRNA的表達；免疫熒光檢測蛋白定位；用MDC染色及YFP—LC3融

2、合蛋白檢測細胞內(nèi)自噬體的形成；用shRNA干擾ATG5，建立ATG5敲除的穩(wěn)定細胞株；用siRNA干擾BNIP3，檢測BNIP3在SYUIQ—5誘導自噬過程中的作用；用分子克隆技術及脂質(zhì)體轉染法建立穩(wěn)定轉染或瞬時轉染的細胞株。 研究結果： 1、SYUIQ—5對CNE2、HeLa、SW620細胞體外增殖活性的影響 為了測定SYUIQ—5對腫瘤細胞體外增殖活性的影響，我們用0.31μg/ml—5μg/ml的SYUIQ

3、—5處理CNE2、HeLa、SW620細胞3天，計算SYUIQ—5對腫瘤細胞的增殖抑制率，可見呈明顯的劑量效應關系，其IC50值分別為0.93μg/ml、0.55μg/ml、0.20μg/ml。結果顯示SYUIQ—5在體外能抑制多種腫瘤細胞的增殖活性。 2、SYUIQ—5誘導腫瘤細胞發(fā)生自噬 2.1 SYUIQ—5對腫瘤細胞中LC3-Ⅰ/Ⅱ轉化的影響 多種腫瘤細胞在SYUIQ—5處理后，Western blot檢

4、測可見LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白表達均有增加，LC3-Ⅱ較LC3-Ⅰ表達更強，增加更明顯。RT—PCR顯示LC3在mRNA水平也有所增強，說明SYUIQ—5處理后能在轉錄水平增強LC3的表達。表明SYUIQ—5能誘導腫瘤細胞發(fā)生自噬，且上調(diào)LC3的表達。 2.2 SYUIQ—5誘導自噬體形成 Monodansylcadaverine是一種熒光染料，可與細胞內(nèi)的酸性囊泡結合，被用作自噬泡的示蹤劑，但MDC并不是自噬泡的特

5、異標志物。SYUIQ—5處理后MDC染色增強并呈點狀化分布。隨后，我們又用免疫熒光觀察到在SYUIQ—5處理的細胞中，YFP—LC3融合蛋白的黃色熒光從均勻分布變?yōu)辄c狀聚集，YFP—LC3的聚集被認為是自噬體形成的特異性標志。為了定量自噬發(fā)生的強度，我們計算了YFP—LC3陽性細胞的比例。以每個細胞中YFP—LC3焦點數(shù)≥5為陽性細胞，其比例在對照組的CNE2和HeLa細胞中分別為21.1％和15.9％，而在SYUIQ—5處理組分別達到

6、71.7％和67.2％。 3、SYUIQ—5對端粒結合蛋白的影響 3.1 SYUIQ—5對端粒結合蛋白TRF1、TRF2表達水平的影響 用0.5-4μg/ml的SYUIQ—5作用CNE2和HeLa細胞48小時后，Western blot檢測各蛋白表達。結果可見TRF2隨著SYUIQ—5濃度的增加表達減少，TRF1在這一過程中無明顯改變。為了檢測以上端粒結合蛋白的改變是發(fā)生在轉錄水平還是轉錄后水平，我們用同上的方法

7、處理細胞后用RT—PCR法檢測其mRNA水平。TRF1和TRF2的mRNA均無明顯變化，說明TRF2的改變發(fā)生在轉錄后水平。 3.2 SYUIQ—5處理前后TRF2在細胞中的定位 用免疫熒光雙染法觀察TRF2在SYUIQ—5處理前后在細胞中的定位。以TRF1作為端粒的標志，對照組中，TRF2蛋白表達豐富且絕大部分與TRF1共定位，在SYUIQ—5處理24h的細胞中，TRF2表達減少且與TRF1位點分離。說明作為G—四鏈體

8、配體的SYUIQ—5能使端粒結合蛋白TRF2從端粒解離。 TRF2在SYUIQ—5處理過程中顯著減少，為了探究其減少的原因，我們聯(lián)合蛋白酶體抑制劑MG-132處理細胞后發(fā)現(xiàn)，MG-132能使SYUIQ—5引起的TRF2減少得到恢復，說明SYUIQ—5在促使TRF2從端粒結合位點解離后被蛋白酶體水解，從而使端粒失去了TRF2的保護。 4、SYUIQ—5引起端粒DNA損傷 4.1 SYUIQ—5誘導,γ—H2AX表

9、達增高 當用0.5-4μg/ml的SYUIQ—5處理CNE2和HeLa細胞48h后，Western blot檢測可見γ—H2AX表達隨用藥濃度的增高而增強，說明SYUIQ—5能引起DNA雙鏈斷裂。免疫熒光也可見到在SYUIQ—5處理的細胞中，γ—H2AX聚集形成的焦點數(shù)明顯增多。同時，我們計數(shù)了γ—H2AX陽性細胞的比例。對照組中的γ—H2AX陽性細胞比例在CNE2和HeLa細胞分別為9.7％和9.2％，而在SYUIQ—5處理組

10、中分別為77.5％和90.7％。 4.2 SYUIQ—5誘導的,γ—H2AX與TRF1共定位 SYUIQ—5能引起γ—H2AX表達增加，說明DNA發(fā)生了損傷。那么其損傷是發(fā)生在全基因組DNA還是具有位點特異性呢？用免疫熒光雙染法檢測γ—H2AX在細胞中的定位，仍然用TRF1作為端粒的標志，可見SYUIQ—5處理后，γ—H2AX的綠色熒光大部分與TRF1的紅色熒光重疊，說明SYUIQ—5能特異性地引起端粒DNA損傷。

11、 4.3 TRF2過表達對SYUIQ—5誘導DNA損傷及自噬的影響 為了說明TRF2在SYUIQ—5引起的DNA損傷及自噬反應中的作用，我們看到在瞬時轉染外源性TRF2使其高表達的腫瘤細胞中，γ—H2AX的表達下調(diào)，且LC3的蛋白水平也有所降低；而轉染突變型TRF2ΔBΔM的細胞，γ—H2AX和LC3表達均上調(diào)，說明野生型TRF2高表達能抑制SYUIQ—5引起的DNA損傷反應和自噬的發(fā)生。另外，我們還篩選出TRF2穩(wěn)定表達的

12、細胞株，MTT結果可見，與轉染載體的對照組相比，TRF2高表達細胞在SYUIQ—5的處理下，其增殖能力和細胞活性較強，進一步說明TRF2高表達能對抗SYUIQ—5的細胞毒作用。 4.4 SYUIQ—5誘導的DNA損傷反應和自噬依賴于ATM的激活 SYUIQ—5處理后，ATM被激活發(fā)生磷酸化。當用ATM的抑制劑CGK733抑制了ATM的活性后，γ—H2AX的表達也隨之減少。說明SYUIQ—5誘導的DNA損傷反應至少是部分

13、依賴于ATM激活的。當用CGK733與SYUIQ—5聯(lián)合作用于細胞時，能減弱SYUIQ—5對細胞增殖活性的抑制作用，更進一步說明ATM的激活在SYUIQ—5引起的DNA損傷反應中起重要作用。同時，我們發(fā)現(xiàn)ATM活性被抑制后，LC3-Ⅱ表達下降，表明自噬被阻斷。 5、SYUIQ—5抑制Akt磷酸化誘導FOXO3a核移位 用不同濃度的SYUIQ—5處理CNE2細胞48小時后，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)p—Akt蛋白表達

14、水平明顯下降，并呈劑量依賴性，而總的Akt在這一過程中無明顯變化。 用0.1％DMSO和3.0μg/ml的SYUIQ—5分別作用CNE2細胞24h后，在共聚焦顯微鏡下觀察FOXO3a在用藥前后在細胞中的定位。結果表明，對照組FOXO3a主要在胞漿中分布，SYUIQ—5處理組則顯示FOXO3a集中分布在胞核中。 6、SYUIQ—5對自噬相關蛋白的影響 用0.25-2μg/ml的SYUIQ—5分別處理CNE2、CNE

15、1和HONE1細胞48h，0.1％的DMSO為對照，Western blot檢測可見BNIP3蛋白表達水平隨藥物濃度的增加而增加，而mRNA無明顯變化。在CNE2細胞中Beclinl無明顯改變。 用siRNA干擾BNIP3，24h后再分別用0.1％DMSO或SYUIQ—5處理CNE2細胞24h。Western blot顯示BNIP3表達下調(diào)后，LC3-Ⅱ的表達也明顯減弱，說明BNIP3在SYUIQ—5誘導的細胞自噬中起著重要作用

16、。 7、N—乙酰半胱氨酸抑制SYUIQ—5誘導自噬 ROS是真核細胞有氧呼吸時的產(chǎn)物，包括超氧陰離子、過氧化氫等。ROS可介導細胞信號轉導，激活轉錄因子，促使基因表達，調(diào)控細胞生長、增殖和凋亡，發(fā)揮重要生物學效應。ROS也可介導自噬的產(chǎn)生。用抗氧化劑NAC拮抗細胞中ROS的產(chǎn)生，能部分抑制LC3-Ⅱ的表達，即抑制了自噬的發(fā)生。因此，刺激細胞產(chǎn)生活性氧自由基而誘導細胞自噬可能是SYUIQ—5誘導CNE2細胞發(fā)生自噬的機制

17、之一。 8、SYUIQ—5誘導腫瘤細胞自噬性死亡 hp—2和hp—7是針對ATG5的兩條shRNA序列。為了明確自噬的發(fā)生在SYUIQ—5介導的細胞死亡中的作用，我們建立了穩(wěn)定轉染shATG5的CNE2和HeLa細胞，ATG5表達顯著下調(diào)，SYUIQ—5誘導的自噬作用也受到阻礙。MTT顯示，在轉染shATG5的CNE2和HeLa細胞中，SYUIQ—5促進細胞死亡和抑制生長的作用明顯減弱，說明SYUIQ—5通過誘導自噬促