饑餓誘導的細胞自噬引起UVRAG分子的降解.pdf

1、目的：
　　觀察細胞發(fā)生自噬后UVRAG分子水平的改變及其與自噬發(fā)生的關(guān)系。
　　方法：
　　將pERFP-LC3真核表達載體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RD-A細胞并與次日用不含胎牛血清的eagle’s液代替常規(guī)培養(yǎng)基，37℃、5％CO2的條件下饑餓培養(yǎng)6小時，用熒光顯微鏡觀察RFP-LC3聚集情況。將生長到對數(shù)生長期的RD-A細胞用不含胎牛血清的eagle’s液代替常規(guī)培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2條件下分別培養(yǎng)2小時、6小時，用We

2、stern Blot檢測饑餓誘導細胞內(nèi)LC3的型別轉(zhuǎn)換及UVRAG分子的水平改變；將生長到對數(shù)生長期的RD-A細胞用不含胎牛血清的eagle’s液代替常規(guī)培養(yǎng)基，同時應(yīng)用自噬起始階段抑制劑3-MA處理細胞，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)6小時，用Western Blot檢測P62和LC3分子的改變及UVRAG分子水平的變化；將生長到對數(shù)生長期的RD-A細胞用不含胎牛血清的eagle’s液代替常規(guī)培養(yǎng)基，同時應(yīng)用溶酶體蛋白酶抑制劑E64d

3、和pepstatin A處理細胞，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)6小時，Western Blot檢測P62和LC3分子的改變及UVRAG分子水平的變化。
　　結(jié)果：
　　1．饑餓可以誘導或促進RD-A細胞發(fā)生自噬；2．RD-A細胞饑餓2小時后， LC3可發(fā)生型別轉(zhuǎn)換，自噬已經(jīng)發(fā)生，但UVRAG分子的水平未見改變，饑餓6小時后細胞自噬進一步發(fā)展，此時UVRAG分子水平也出現(xiàn)降低；3．用自噬抑制劑3-MA處理饑餓細胞，細胞自噬水