UVRAG基因在自噬及心臟結(jié)構(gòu)功能維持中的作用.pdf

1、UVRAG（ultraviolet radiation resistance-associated gene）最初發(fā)現(xiàn)于著色性干皮病細胞中，它能部分地恢復該細胞對紫外線的耐受。后來 UVRAG被鑒定為一個腫瘤抑制基因，并且有多種生物學功能，例如細胞自噬，細胞內(nèi)吞和DNA修復等。近來，大量的研究增加了對UVRAG的結(jié)構(gòu)和多種生物學功能的理解，但是其生理學功能依然所知甚少。
　　利用piggyBac（PB）轉(zhuǎn)座子插入產(chǎn)生的UVRAG基

2、因敲除小鼠模型，我們研究UVRAG在心臟細胞自噬和維持心臟形態(tài)和功能中的作用。PB轉(zhuǎn)座子插入位點位于UVRAG基因的第十四個內(nèi)含子，RT-PCR實驗結(jié)果顯示，PB轉(zhuǎn)座子的插入干擾小鼠心臟組織UVRAG mRNA的表達。免疫印跡實驗結(jié)果顯示，敲除小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺、骨骼肌和腦等組織中無UVRAG蛋白表達。但UVRAG缺失（UVRAGPB/PB）小鼠依舊可存活，有繁殖能力，發(fā)育正常。
　　免疫印跡結(jié)果顯示UVRAG缺失小鼠心臟中

3、LC3 II蛋白顯著提高，提示其自噬體數(shù)量增加。LC3免疫熒光染色結(jié)果顯示UVRAG缺失心臟細胞中LC3陽性熒光點狀結(jié)構(gòu)數(shù)量顯著增加。透射電鏡結(jié)果顯示，UVRAG缺失心臟中自噬體數(shù)量顯著增加。自噬體合成增加和自噬清除受損均可導致自噬體數(shù)量增加。免疫印跡顯示UVRAG缺失心臟中p62蛋白含量增加，提示自噬流受損。與野生型相比，UVRAG缺失小鼠心臟LC3 II蛋白水平增加，氯喹（Chloroquine）處理小鼠阻斷自噬體溶酶體融合后，野生

4、型小鼠心臟LC3 II顯著提高，但是UVRAG缺失心臟LC3 II與處理前相比沒有顯著差異。表明UVRAG缺失心臟中自噬流受損，自噬體清除受阻導致自噬體累積。Western blot結(jié)果顯示UVRAG缺失心臟溶酶體分子標記物LAMP-1和LAMP-2都顯著增加。在小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）中，UVRAG的缺失也導致自噬流受損，自噬體數(shù)量增加。
　　在心臟形態(tài)和功能方面，兩月齡和六月齡UVRAG缺失小鼠心臟擁有與野生型小鼠一樣的

5、形態(tài)和功能。但十月齡UVRAG缺失小鼠心臟體積顯著大于野生型對照組。心臟組織橫截面切片染色顯示，UVRAG缺失小鼠心臟橫截面變大，左心室室腔變大，心室壁變薄。H&E染色結(jié)果揭示，與野生型相比UVRAG缺失小鼠單位視野內(nèi)心肌細胞數(shù)量較少，單個心肌細胞橫截面顯著增加。表明十月齡時UVRAG缺失小鼠出現(xiàn)心肌肥厚。
　　天狼猩紅染色結(jié)果顯示，十月齡UVRAG缺失小鼠心臟出現(xiàn)間質(zhì)膠原累積。實時定量PCR結(jié)果顯示，十月齡UVRAG缺失心臟心室

6、重構(gòu)分子標記物表達量顯著升高，例如心鈉素（ANF）和腦鈉肽（BNP）。免疫印跡實驗結(jié)果顯示，十月齡UVRAG缺失小鼠心臟組織Bax蛋白水平高于野生型對照組。TUNEL（Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling）檢測小鼠心臟切片，結(jié)果顯示與野生型相比十月齡UVRAG缺失小鼠心臟細胞凋亡數(shù)量顯著增加。
　　實時定量PCR結(jié)果顯示，十月齡UVRAG

7、缺失心臟促炎性細胞因子表達量顯著增加，例如白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（Tumour necrosis factor-α，TNFα）。免疫組織化學染色檢測結(jié)果顯示UVRAG缺失心臟CD45和CD45R陽性信號顯著增加，表明心臟組織中有炎性細胞浸潤。實時熒光定量PCR顯示，十月齡UVRAG缺失小鼠心臟樹突細胞分子標記物CD11c表達量顯著高于野生型，單核細胞趨化因子 MCP-1顯著增加，而巨噬細

8、胞前體細胞分子標記物F4/80，M1型巨噬細胞分子標記物CD68，M2型巨噬細胞CD163等均與野生型無顯著差異。脂多糖（LPS）處理實驗小鼠，誘導產(chǎn)生膿血癥模型，促炎性因子顯著提高，但UVRAG缺失小鼠與野生型小鼠相比無顯著差異，表明在小鼠心臟中，UVRAG缺失與LPS誘導的促炎性因子的表達無直接關系。
　　超聲心動圖結(jié)果顯示，十月齡UVRAG缺失小鼠心臟左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）和左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）顯著增加