自噬在痛風(fēng)炎癥中的作用研究.pdf

1、目的：
　　痛風(fēng)（gout）是尿酸或尿酸鹽（monosodium urate,MSU）結(jié)晶沉積于組織或器官引起的一組臨床綜合征，包括高尿酸血癥，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，痛風(fēng)性腎病及腎石病。痛風(fēng)患病率在世界范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢。流行病學(xué)研究顯示，歐洲痛風(fēng)患病率達(dá)1.4％，我國山東沿海地區(qū)的痛風(fēng)患病率1.14%。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的一個顯著特征是炎癥發(fā)作一周左右可自發(fā)緩解，是痛風(fēng)區(qū)別于其他關(guān)節(jié)病或自身炎性疾病的顯著特征之一，但痛風(fēng)炎癥自限性又易反

2、復(fù)發(fā)作的確切分子機(jī)制目前仍不清楚。研究表明，固有免疫參與了尿酸鹽晶體觸發(fā)痛風(fēng)炎癥反應(yīng)，其中NOD樣受體（NOD-like receptors,NLRs）家族中的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(The NACHT,LRR and PYD domains-containing protein3.NLRP3)能識別MSU，MSU激活NLRP3炎性體釋放出炎癥因子IL-1β，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)MSU刺激NLRP3炎性體活化伴隨自噬活性增加，自

3、噬又可以通過直接或間接作用負(fù)調(diào)控NLRP3炎性體限制炎癥因子IL-1β的產(chǎn)生，提示自噬可能參與了痛風(fēng)炎癥反應(yīng)的調(diào)控。我國傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，痛風(fēng)的病機(jī)為脾胃運(yùn)化功能失常。痛風(fēng)急性發(fā)作期最常見中醫(yī)證型是濕熱蘊(yùn)結(jié)證，治療以清熱利濕解毒為主，而白藜蘆醇具有清熱解毒、健脾胃的功效。白藜蘆醇對膠原誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎均有良好的抗炎效果。研究表明白藜蘆醇作為Sirtuin1(SIRT1)天然激動劑，白藜蘆醇可以激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/SI

4、RT1通路，參與自噬誘導(dǎo)，但其具體機(jī)制還不清楚。本課題擬通過研究痛風(fēng)患者自噬表達(dá)變化特點(diǎn)、自噬調(diào)控NLRP3炎性體活性以及白藜蘆醇調(diào)控自噬水平探討自噬在痛風(fēng)炎癥中的調(diào)控作用。
　　方法：
　　1.收集48例急性期（acute gout,AG）、40例間歇期(intercritical gout,IG)痛風(fēng)患者和同期體檢的80例健康對照者(healthy control,HC)者的臨床及實(shí)驗(yàn)室資料，以及外周靜脈血標(biāo)本；其中間歇

5、期痛風(fēng)患者6例用于MSU刺激、MSU聯(lián)合自噬調(diào)控劑共刺激和MSU聯(lián)合白藜蘆醇共刺激進(jìn)行功能研究。
　　2.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測間歇期痛風(fēng)患者外周血經(jīng)MSU、自噬調(diào)控劑、白藜蘆醇刺激后的細(xì)胞活性。應(yīng)用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time quant itative,RT-qPCR)及western blot檢測外周血單個核細(xì)胞的beclin-1、LC3、NLRP3、ASC、SIRT1、IL-1β的基因及蛋白表達(dá)水平。采用ELI

6、SA檢測間歇期痛風(fēng)患者外周血不同因素刺激后血漿中IL-1β濃度。
　　3.統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包及GraphPad Prism6進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用中位數(shù)（四分位間距）[M(QR)]或均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示，采用單因素方差分析（ANOVA）結(jié)果，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.與健康對照者比較，痛風(fēng)患者除炎癥細(xì)胞升高外，伴有體重指數(shù)、血壓、血糖

7、、血脂等多種代謝指標(biāo)升高（P<0.05或0.01）。
　　2.AG、IG患者的外周血單個核細(xì)胞beclin-1mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著低于正常對照者(P均<0.01)，而LC3mRNA在AG、IG的表達(dá)水平顯著高于正常對照者(P均<0.01)；LC3-II蛋白水平在AG的表達(dá)水平顯著高于IG及正常對照者(P均<0.01)，IG及正常對照者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　3.MSU刺激IG患者外周血1、3小時后bec

8、lin-1蛋白水平較無刺激組顯著增高(P均<0.01)，而MSU刺激6小時后beclin-1蛋白水平較未刺激組則顯著降低（P<0.01）。
　　4.IG患者M(jìn)SU、MSU+自噬激動劑(雷帕霉素）、MSU+自噬抑制劑[3-甲基腺嘌呤（3-MA）、巴佛洛霉素A1（Baf A1）、E64d+胃蛋白酶A（E64d+pep A）]刺激組LC3-II蛋白水平較空白對照（DMSO、PBS）均顯著增強(qiáng)（P均<0.01），MSU、MSU+雷帕霉素組

9、的beclin-1蛋白水平較空白對照組(DMSO、PBS)顯著降低（P均<0.01），而MSU+自噬抑制劑組(3-MA、Baf A1、E64d+pep A)的beclin-1蛋白水平較MSU、MSU+雷帕霉素組顯著升高（P均<0.01）。而正常對照者M(jìn)SU組、MSU+雷帕霉素組的beclin-1蛋白水平較空白對照組無顯著差異（P均>0.05），而MSU+自噬抑制劑組(3-MA、Baf A1、E64d+pep A)的beclin-1蛋白水

10、平顯著低于空白對照、MSU、MSU+雷帕霉素組（P均<0.01）。
　　5.痛風(fēng)患者NLRP3mRNA在AG的表達(dá)水平顯著低于HC(P<0.05)，AG與IG，IG與HC間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；ASC mRNA在AG的表達(dá)水平顯著高于IG、HC(P分別<0.01，0.05)，IG與HC間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。NLRP3和ASC蛋白水平在AG、IG期顯著低于HC（P均<0.01），且IG ASC蛋白水平較AG更低（P

11、<0.05）；AG患者ASC亞型（ASC-b）蛋白水平顯著高于IG、HC（P均<0.01），而且IG的ASC-b較HC顯著降低（P<0.05）。
　　6.IG患者在MSU、MSU+雷帕霉素刺激組ASC蛋白水平較空白對照（DMSO）均顯著降低（P均<0.01），且MSU+雷帕霉素組較MSU組ASC蛋白水平更低（P<0.01），而MSU+自噬抑制劑組(3-MA、Baf A1、E64d+pep A)的ASC蛋白水平較空白對照、MSU、M

12、SU+雷帕霉素組顯著升高（P均<0.01）。
　　7.IG患者空白對照組未能明顯檢測出caspase-1p20蛋白表達(dá)，MSU刺激組caspase-1p20蛋白表達(dá)水平較空白對照顯著升高（P<0.01），而MSU+雷帕霉素組caspase-1p20表達(dá)水平較MSU組顯著降低（P<0.01）。MSU、MSU+雷帕霉素組IL-1β蛋白水平較空白對照（DMSO）均顯著升高（P均<0.01），并且MSU+雷帕霉素組較MSU組IL-1β蛋白

13、水平降低（P<0.01），而MSU+自噬抑制劑組(3-MA、Baf A1、E64d+pep A)的IL-1β蛋白水平較空白對照、MSU+雷帕霉素組顯著升高（P均<0.01）。
　　8.痛風(fēng)患者SIRT1mRNA在AG、IG的表達(dá)水平顯著低于正常對照者(P均<0.05)，AG與IG間比較，AG SIRT1mRNA更低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；AG、IG組SIRT1蛋白水平顯著低于HC組（P分別<0.01，0.05），AG組S

14、IRT1表達(dá)水平顯著低于IG組（P<0.01）。200μg/ml和400μg/ml白藜蘆醇聯(lián)合MSU組SIRT1與MSU組比較顯著升高（P均<0.01），而100μg/ml白藜蘆醇組SIRT1較MSU組有所升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　9.MSU刺激組的beclin-1、LC3mRNA表達(dá)水平較空白對照組顯著升高（P均<0.01）；白藜蘆醇聯(lián)合MSU組beclin-1mRNA與MSU組比較，200μg/ml和400μ

15、g/ml白藜蘆醇聯(lián)合MSU組顯著減低（P均<0.01）；而白藜蘆醇聯(lián)合MSU組的LC3mRNA與MSU組比較，隨白藜蘆醇組濃度增大無顯著降低，LC3mRNA保持在較高水平。100μg/ml和200μg/ml白藜蘆醇聯(lián)合MSU組的beclin-1蛋白水平較空白對照組、MSU組顯著增高（P均<0.01），400μg/ml白藜蘆醇聯(lián)合MSU組beclin-1蛋白水平與空白對照、MSU組無顯著差異（P>0.05）；LC3-II蛋白水平在MSU、

16、不同濃度白藜蘆醇聯(lián)合MSU組均較空白對照組升高（P均<0.01），且隨白藜蘆醇濃度升高而降低。
　　10.100μg/ml和200μg/ml白藜蘆醇聯(lián)合MSU組的IL-1β前體（IL-1βp31）蛋白水平較MSU組增高（P均<0.01），400μg/ml白藜蘆醇聯(lián)合MSU組IL-1β前體低于MSU組（P<0.05），而IL-1βp17在200μg/ml和400μg/ml白藜蘆醇聯(lián)合MSU組較MSU組顯著降低（P均<0.01）。我們

17、也檢測了外周血血漿中IL-1β蛋白水平，MSU刺激外周血釋放至血漿中的IL-1β較空白對照組顯著升高（P<0.01）,在200μg/ml和400μg/ml白藜蘆醇聯(lián)合MSU組較MSU組顯著降低（P均<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.痛風(fēng)患者除炎癥指標(biāo)升高外，易伴有高體重指數(shù)、高血壓、高血糖、高血脂等多種代謝紊亂。
　　2.急性期痛風(fēng)患者的自噬水平顯著增強(qiáng)，自噬參與了痛風(fēng)炎癥發(fā)病機(jī)制。
　　3.痛風(fēng)患者自噬通量顯