大自噬在小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥及多巴胺神經(jīng)元損傷中的作用.pdf

1、目的：
　　大自噬在小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥及多巴胺神經(jīng)元損傷中的作用。
　　方法：
　　以BV2細(xì)胞和原代小膠質(zhì)細(xì)胞為研究對象，采用腫瘤壞死因子（TN F-α）和細(xì)菌脂多糖（LPS）建立細(xì)胞炎癥模型。
　　第一部分：采用Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3（microtubule-associated protein light chain3）、 p62及Beclin1的表達(dá)水平；Q-PCR法檢測小

2、膠質(zhì)細(xì)胞M1和M2表型marker的mRNA水平的變化；
　　第二部分：采用定量和逆轉(zhuǎn)錄PCR（Quantitative and reverse transcription PCR）檢測M1表型marker( iNOS、IL-1β)以及 M2表型marker( Arginase、Ym1/2) mRNA水平的變化；用研究自噬的工具藥（雷帕霉素,白藜蘆醇,3甲基腺嘌呤）、血清剝奪和敲減自噬相關(guān)基因Atg5，Q-PCR法檢測M1及M2表

3、型marker mRNA水平的變化；
　　第三部分：將原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的上清以1:2的比例和神經(jīng)元培養(yǎng)基混合后，和原代中腦神經(jīng)元共同培養(yǎng)24h，通過CCK8檢測不同組別原代中腦神經(jīng)元細(xì)胞的活力，并通過免疫熒光以MAP-2標(biāo)記神經(jīng)元觀察神經(jīng)元突起的變化。
　　結(jié)果：
　　第一部分：TNF-α（1ng/ml和5ng/ml）作用于小膠質(zhì)細(xì)胞可以使自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1、p62升高（P<0.05），激活自噬；TN

4、F-α（5ng/ml）作用于小膠質(zhì)細(xì)胞，可以使小膠質(zhì)細(xì)胞M1 marker(iNOS、IL-1β)的mRNA水平升高（P<0.05），而M2 marker( Arginase、Ym1/2)的mRNA水平下降（P<0.05）。
　　第二部分：在TNF-α(5ng/ml)和LPS（100ng/ml）作用于小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞模型上，用研究自噬的工具藥上調(diào)自噬，可以發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞M1 marker(iNOS、IL-1β)的mRNA水平下降（

5、P<0.05）而 M2 marker(Arginase、Ym1/2)的mRNA水平升高（P<0.05）；而下調(diào)自噬，觀察到相反的變化。
　　第三部分：通過CCK8檢測神經(jīng)元活力發(fā)現(xiàn)，和單獨(dú)TNF-α作用組的小膠質(zhì)細(xì)胞上清共培養(yǎng)后神經(jīng)元活力下降；神經(jīng)元和抑制自噬組的小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)上清共培養(yǎng)后，中腦神經(jīng)元活力下降更明顯；同樣和抑制自噬組的小膠質(zhì)細(xì)胞上清共培養(yǎng)，中腦神經(jīng)元的突起明顯的縮短；與增強(qiáng)自噬的小膠質(zhì)細(xì)胞上清共培養(yǎng)觀察到相反的