雷帕霉素與細(xì)胞自噬在哮喘氣道炎癥和嗜酸粒細(xì)胞分化中的作用研究.pdf

1、支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘）是一種以嗜酸性粒細(xì)胞(Eosinophils，Eos)、肥大細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主的氣道慢性炎癥性疾病，表現(xiàn)為氣道高反應(yīng)性和可逆性氣流受限。其中嗜酸性粒細(xì)胞是哮喘過(guò)敏性氣道炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，Eos與哮喘發(fā)病之間存在直接因果關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸性粒細(xì)胞在哮喘發(fā)病過(guò)程中參與多種功能調(diào)控，包括抗原提呈，細(xì)胞因子、趨化因子、顆粒介質(zhì)以及白三烯的釋放等。嗜酸性粒細(xì)胞是由骨髓共同髓系祖細(xì)胞(CMP)經(jīng)由粒-單核系祖細(xì)胞

2、(GMP)，由嗜酸性粒細(xì)胞祖細(xì)胞(EoP)定向分化成熟。嗜酸性粒細(xì)胞分化涉及多種轉(zhuǎn)錄因子（GATA-1等）和細(xì)胞因子，如白介素3(IL-3)，IL-5，粒-單核集落刺激因子(GM-CSF)，其中IL-5對(duì)Eos最終分化成熟起最主要的調(diào)節(jié)作用。然而，目前對(duì)于哮喘發(fā)病過(guò)程中Eos調(diào)控機(jī)制的研究并不多.
　　細(xì)胞自噬(autophagy)是機(jī)體一種重要的防御和保護(hù)機(jī)制。在某些特定的微環(huán)境條件（如饑餓，生長(zhǎng)素缺乏）下，細(xì)胞內(nèi)形成一種雙層膜

3、結(jié)構(gòu)的囊泡，細(xì)胞自噬體（autophagosomes），并同時(shí)捕獲細(xì)胞內(nèi)的受損的細(xì)胞器（如線(xiàn)粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）和變性的蛋白質(zhì)等;然后該囊泡與溶酶體溶合，形成自噬溶酶體(autolysosomes)。在溶酶體水解酶等的作用下，自噬體所包含的各種細(xì)胞器和生物大分子得以消化和降解，從而為重新合成新的生物大分子提供原料和能量。因此從本義上講，細(xì)胞自噬是機(jī)體保持內(nèi)穩(wěn)態(tài)(homeostasis)和適應(yīng)微環(huán)境改變的一種重要的自我調(diào)節(jié)和保護(hù)機(jī)制。然而，在某

4、些特定的條件下，細(xì)胞器和各種生物大分子的過(guò)量消耗最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的另一種程序性死亡，細(xì)胞自噬死亡(autophagiccell death)。由于細(xì)胞自噬能保護(hù)或者促進(jìn)細(xì)胞死亡，因此在不同的疾病病變過(guò)程中，其功能截然不同。越來(lái)越多的研究表明，自噬在機(jī)體的免疫、感染、炎癥、腫瘤、心血管病、神經(jīng)退行性病的發(fā)病中具有十分重要的作用。然而，細(xì)胞自噬在呼吸系統(tǒng)的研究并不多。新近有研究開(kāi)創(chuàng)性地闡明了細(xì)胞自噬在吸煙誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞損傷以及慢性阻塞性肺

5、疾病(COPD)形成過(guò)程中的重要調(diào)控作用。然而，細(xì)胞自噬在支氣管哮喘分子發(fā)病機(jī)制中的作用鮮有研究報(bào)導(dǎo)。
　　雷帕霉素（rapamycin）是經(jīng)典的細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑，是1975年從加拿大Easter島上的吸水鏈霉菌中提取的一種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素。雷帕霉素的主要作用靶點(diǎn)，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)能接受并整合生長(zhǎng)因子、能量、氧氣和氨基酸四大主要信號(hào)，參與調(diào)節(jié)能量代謝、蛋白

6、質(zhì)、脂質(zhì)、細(xì)胞器的合成以及細(xì)胞自噬等生理過(guò)程，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡中起著重要的調(diào)控作用，從而維持機(jī)體與細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)平衡。研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素在哮喘動(dòng)物模型中的作用并不一致，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能抑制過(guò)敏性氣道炎癥，氣道高反應(yīng)性，杯狀細(xì)胞化生和IgE產(chǎn)生，但也有部分研究認(rèn)為雷帕霉素對(duì)過(guò)敏性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性沒(méi)有影響。然而，最關(guān)鍵的是這些研究均只簡(jiǎn)單利用雷帕霉素體內(nèi)干預(yù)觀(guān)察哮喘表型，并未闡明雷帕霉素及mTOR在哮喘發(fā)病機(jī)制中起到關(guān)鍵調(diào)

7、控作用及其具體機(jī)制。
　　越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬和mTOR在造血干細(xì)胞分化和增殖中起到重要作用。自噬缺陷可抑制紅系造血導(dǎo)致嚴(yán)重貧血、抑制T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞數(shù)目和功能，而mTOR通過(guò)調(diào)控T細(xì)胞分化、功能、代謝參與調(diào)控適應(yīng)性免疫應(yīng)答。由此，我們假設(shè)細(xì)胞自噬和mTOR也參與骨髓粒系祖細(xì)胞尤其是嗜酸性粒細(xì)胞分化的調(diào)控，并進(jìn)一步探討其在以嗜酸性粒細(xì)胞氣道炎癥為主要表現(xiàn)的整體哮喘模型中的可能作用與貢獻(xiàn)，從而為哮喘分子發(fā)病機(jī)制的研究開(kāi)拓

8、新的視野，為哮喘臨床的防治提供新的靶點(diǎn)。
　　本實(shí)驗(yàn)分兩部分進(jìn)行研究:(1)探求雷帕霉素及mTOR在哮喘氣道炎癥和骨髓嗜酸性粒細(xì)胞分化中的作用;(2)利用細(xì)胞自噬相關(guān)基因敲除小鼠Beclin1+/-和骨髓移植技術(shù)，分別闡明細(xì)胞自噬在氣道上皮細(xì)胞損傷和骨髓嗜酸性粒細(xì)胞分化中的不同調(diào)控作用。
　　第一部分雷帕霉素在哮喘氣道炎癥和嗜酸粒細(xì)胞分化中的作用研究
　　目的:研究雷帕霉素干預(yù)對(duì)哮喘氣道炎癥的影響，并探討雷帕霉素在OV

9、A誘導(dǎo)肺組織T細(xì)胞免疫應(yīng)答及骨髓嗜酸性粒細(xì)胞分化過(guò)程中的調(diào)控作用。
　　方法:健康雌性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為四組:生理鹽水對(duì)照組（SHAM組）、模型組（OVA組）、雷帕霉素對(duì)照組（SHAM+RAPA組）、雷帕霉素哮喘組(OVA+RAPA組)。以卵白蛋白(OVA)致敏和激發(fā)建立哮喘模型，生理鹽水對(duì)照組以同等劑量的生理鹽水代替OVA，雷帕霉素組在每次抗原激發(fā)前1小時(shí)進(jìn)行腹腔注射（1 mg/kg）。于最后一次抗原激發(fā)后24小時(shí)檢測(cè)

10、肺泡灌洗液(BALF)、外周血和骨髓中的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù);肺組織病理切片觀(guān)察氣道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況，ELISA檢測(cè)血清中IL-5，IL-13水平。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)和分析肺組織Th2，Th17，Treg各T細(xì)胞亞群的比例，同時(shí)檢測(cè)骨髓中嗜酸性粒細(xì)胞祖細(xì)胞(EoP, Lin-Sca-1-CD34+IL-5Ra+c-Kitlo)的比例。Western blot檢測(cè)骨髓嗜酸性粒細(xì)胞分化過(guò)程中mTOR水平變化，體外克隆形成試驗(yàn)及骨髓Eos誘導(dǎo)分化培養(yǎng)檢

11、測(cè)雷帕霉素干預(yù)對(duì)骨髓嗜酸性粒細(xì)胞分化及功能的影響。最后利用IL-5轉(zhuǎn)基因小鼠NJ.1638，連續(xù)3天腹腔注射雷帕霉素，檢測(cè)外周血和骨髓中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)，ELISA檢測(cè)血清中IL-5水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓EoP的比例以及嗜酸性粒細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果:雷帕霉素干預(yù)后顯著緩解OVA誘導(dǎo)的氣道過(guò)敏性炎癥，但是不影響肺組織中Th2細(xì)胞，Th17細(xì)胞和Treg水平。雷帕霉素抑制了氣道局部以及外周血，骨髓嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目，但是并不改變血清

12、IL-5水平。體外克隆形成試驗(yàn)和骨髓Eos誘導(dǎo)分化培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可以直接抑制IL-5介導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞分化及培養(yǎng)上清Eos分泌IL-6和IL-13的水平。離體骨髓克隆形成試驗(yàn)及骨髓流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果提示，雷帕霉素對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞分化的抑制最終導(dǎo)致骨髓嗜酸性粒細(xì)胞祖細(xì)胞的聚集。對(duì)IL-5轉(zhuǎn)基因小鼠NJ.1638的研究同樣證實(shí)了雷帕霉素對(duì)外周血和骨髓嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)的抑制作用及骨髓EoP的聚集，并不依賴(lài)其血清高表達(dá)IL-5水平的改變，也不影

13、響嗜酸性粒細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論:雷帕霉素可以緩解哮喘小鼠氣道過(guò)敏性炎癥，可能是通過(guò)抑制骨髓嗜酸性粒細(xì)胞分化及功能，而對(duì)Eos凋亡和肺組織T細(xì)胞免疫無(wú)明顯影響。
　　第二部分細(xì)胞自噬在哮喘氣道炎癥和嗜酸粒細(xì)胞分化中的作用研究
　　目的:研究細(xì)胞自噬敲除對(duì)哮喘整體模型的影響，并探討細(xì)胞自噬在OVA誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞損傷和骨髓嗜酸性粒細(xì)胞分化過(guò)程中的不同調(diào)控作用。
　　方法:通過(guò)Western blot檢測(cè)哮喘小鼠骨

14、髓及體外嗜酸性粒細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中自噬水平變化，并利用細(xì)胞自噬相關(guān)基因缺陷小鼠Beclin1+/-，通過(guò)瑞士-吉姆薩染色分析其外周血和骨髓中嗜酸性粒細(xì)胞的水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其骨髓嗜酸性粒細(xì)胞祖細(xì)胞水平，并通過(guò)甲基纖維素克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)其骨髓嗜酸性粒細(xì)胞分化能力。同時(shí)利用Beclin1+/-小鼠及其同窩生WT小鼠以O(shè)VA致敏和激發(fā)建立哮喘模型，隨機(jī)分組如下:野生型生理鹽水對(duì)照組(WT/NS)，野生型哮喘模型組(WT/OVA)，Becli

15、n1+/-小鼠生理鹽水對(duì)照組(BECN/NS)和Beclin1+/-小鼠哮喘模型組（BECN/OVA）。末次激發(fā)后24小時(shí)，采用有創(chuàng)方法測(cè)定小鼠氣道反應(yīng)性，并檢測(cè)氣道灌洗液中的白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù);肺組織病理切片觀(guān)察氣道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和粘液分泌情況，電鏡觀(guān)察哮喘小鼠氣道上皮細(xì)胞自噬泡聚集情況。體外培養(yǎng)人正常肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)，Western blot檢測(cè)OVA體外干預(yù)過(guò)程中自噬水平變化，Q-PCR檢測(cè)饑餓誘導(dǎo)自噬及IL-1

16、3體外干預(yù)對(duì)粘蛋白MUC5AC mRNA的表達(dá)情況。最后采用骨髓移植的方法，白硝胺+環(huán)磷酰胺聯(lián)合化療毀損野生型小鼠骨髓遣血系統(tǒng)，然后將Beclin1+/-小鼠或同窩生野生型小鼠骨髓移植至野生型小鼠并重建其造血系統(tǒng)，OVA誘導(dǎo)建立哮喘模型，根據(jù)回輸骨髓不同分兩組:WT-WT-OVA組和BECN-WT-OVA組，觀(guān)察骨髓局部自噬敲除對(duì)哮喘整體模型氣道高反應(yīng)和氣道炎癥的貢獻(xiàn)。
　　結(jié)果:細(xì)胞自噬相關(guān)基因敲除小鼠Beclin1+/-，與同

17、窩生野生型（WT）小鼠相比，外周血和骨髓中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目顯著增多，骨髓EoP水平雖有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。體外Eos誘導(dǎo)分化過(guò)程中LC3B蛋白水平的改變提示細(xì)胞自噬參與骨髓嗜酸性粒細(xì)胞分化。體外克隆形成試驗(yàn)直接證實(shí)，Beclin1+/-小鼠骨髓生成嗜酸性粒細(xì)胞克隆形成單位能力增加。但Beclin1+/-小鼠抗原激發(fā)后氣道反應(yīng)性、氣道炎癥、粘液高分泌，與野生型小鼠模型組相比并未惡化，反而出現(xiàn)明顯減輕。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，雖然哮喘小鼠骨髓中LC

18、3B蛋白水平下降，但電鏡可見(jiàn)哮喘氣道上皮細(xì)胞中存在細(xì)胞自噬泡聚集。并且體外實(shí)驗(yàn)表明，OVA干預(yù)可上調(diào)LC3B蛋白水平，饑餓誘導(dǎo)自噬可進(jìn)一步增強(qiáng)IL-13介導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞MUC5AC mRNA的表達(dá)。在骨髓移植實(shí)驗(yàn)中，Beclin1+/-小鼠骨髓回輸?shù)南∈?BECN-WT-OVA組)，氣道反應(yīng)性和氣道炎癥都明顯高于野生型小鼠骨髓回輸?shù)南∈螅╓T-WT-OVA組）。
　　結(jié)論:細(xì)胞自噬敲除雖然在動(dòng)物模型中整體表現(xiàn)為可以