cGMP的心肌保護作用及自噬在MIRI中的作用.pdf

1、第一部分:環(huán)磷酸鳥苷的心肌雙重保護作用及其機制的探討
　　環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine3’5’-monophosphate，cGMP）是細胞內(nèi)一種第二信使，是由可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（soluble guanosine cyclase，sGC）和顆粒狀鳥苷酸環(huán)化酶（particulate guanylyl cyclase，pGC）催化GTP轉(zhuǎn)化而生成。作為一種重要的細胞內(nèi)信使物質(zhì)，cGMP有3個主要靶點：cGMP-依賴

2、的蛋白激酶或蛋白激酶G（proteinkinase G，PKG），cGMP-調(diào)節(jié)的cAMP磷酸二酯酶，以及cGMP控制的離子通道。其中，PKG被認為是最重要的cGMP下游靶點。在生理條件下，PKG通過松弛平滑肌細胞、抑制內(nèi)皮細胞通透性、抑制血小板活化以及對心肌細胞的負性肌力作用保護心血管系統(tǒng)。最近有研究報道，cGMP/PKG信號途徑在缺血預(yù)處理和后處理的心臟保護機制中發(fā)揮重要作用。另有報道指出，磷酸二酯酶-5抑制劑西地那非（silden

3、afil，偉哥）通過增加cGMP的積聚激活PKG，進而保護缺血/再灌注的心肌細胞。然而cGMP/PKG信號途徑保護心臟的具體機制尚不清楚。
　　目前研究認為，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)移孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）的開放是導(dǎo)致缺血/再灌注損傷的關(guān)鍵因素，抑制mPTP的開放是許多心臟保護物質(zhì)抗缺血/再灌注損傷的共同機制。雖然有人提出，mPTP可能是cGMP/PKG信號途徑

4、引起心臟保護的最終靶點，但尚未被證實。糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase3β，GSK-3β）在心肌保護中也起非常重要的作用，其機制主要是通過Ser9位點的磷酸化抑制其活性，從而阻止mPTP的開放并保護再灌注損傷的心肌。已有研究證明，西地那非通過PKG信號通路使心肌細胞GSK-3β失活。推測，cGMP很可能通過GSK-3β的失活抑制mPTP的開放。磷脂酰肌醇三激酶（phosphoinositide3-ki

5、nase，PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號途徑抑制GSK-3β的活性，并有報道此途徑可能被西地那非激活。同樣可以設(shè)想，cGMP/PKG信號可能通過PI3K/Akt使GSK-3β失活。PI3K/Akt的激活雖對缺血預(yù)處理心臟起保護作用，但是過度的Akt活化可以誘發(fā)病理性心室重構(gòu)和心力衰竭。因此，探討cGMP對Akt活性的影響及其可能機制具有重要意義。
　　本實驗利用 H9c2大鼠心肌細胞株，探討 cGMP的心臟保護作用是否通過G

6、SK-3β的失活并抑制 mPTP開放而引起，并進一步觀察 cGMP是否通過影響Akt的活性使GSK-3β失活。
　　為了探討cGMP能否使GSK-3β失活，本研究用cGMP類似物8-Br-cGMP（500μmol/L）處理H9c2細胞30 min，利用Western blotting方法觀察GSK-3βSer9位點磷酸化的情況。結(jié)果顯示，8-Br-cGMP明顯增加GSK-3β的磷酸化，表明cGMP能夠抑制GSK-3β的活性。因為P

7、KG是cGMP的重要下游因子，本實驗通過測定 PKG的主要底物血管擴張刺激磷蛋白（vasodilator-stimulated phosphoprotein，VASP）的磷酸化水平檢測了PKG的活性。結(jié)果顯示，8-Br-cGMP明顯增加VASP的磷酸化，提示8-Br-cGMP能夠激活PKG。cGMP抑制GSK-3β活性的效應(yīng)被特異性PKG抑制劑KT5823（10μmol/l）所逆轉(zhuǎn)，提示cGMP是通過PKG抑制GSK-3β的活性。進一步

8、的實驗顯示，8-Br-cGMP本身并不能明顯增強GSK-3β磷酸化，而必須和PKG Iα共同作用時才表現(xiàn)出增加GSK-3β磷酸化的作用，進一步證實了cGMP通過PKG抑制GSK-3β的活性。同樣，8-Br-cGMP與PKG Iα的直接相互作用使純化GSK-3β的磷酸化明顯增加。以上結(jié)果表明cGMP通過PKG使GSK-3β失活。
　　為了探討cGMP能否阻止mPTP開放，本實驗利用激光共聚焦顯微鏡成像技術(shù)和熒光染色方法（四甲基羅丹明

9、乙酯tetramethyrhodamine ester，TMRE）測定了線粒體膜電位，以此判斷mPTP的開放程度。結(jié)果顯示，cGMP明顯抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的TMRE熒光強度的減少，說明cGMP能夠抑制mPTP的開放。用激活型GSK-3β質(zhì)粒（GSK-3β-S9A）轉(zhuǎn)染細胞，使GSK-3β處于持續(xù)激活狀態(tài)后，cGMP沒能抑制TMRE熒光強度的減少。由于抑制GSK-3β的活性可阻止mPTP的開放，此結(jié)果進一步證明cGMP通過抑制GSK-3β活

10、性而阻止mPTP的開放。
　　為了進一步闡明 cGMP是否通過影響 Akt活性而使 GSK-3β失活，實驗用Western blotting檢測了Akt Ser473位點的磷酸化。我們意外地發(fā)現(xiàn)，8-Br-cGMP不能增加Akt的磷酸化，反而使其減少，提示cGMP的積聚可迅速抑制Akt的活性。為了證實這一發(fā)現(xiàn)，我們進一步檢測了非特異性磷酸二酯酶抑制劑異丁基甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX

11、，200μmol/L）能否模擬cGMP的這種作用而抑制Akt的磷酸化。結(jié)果表明，IBMX使Akt的磷酸化明顯減少，卻增強VASP的磷酸化，表明IBMX通過cGMP抑制Akt的活性。進一步的實驗結(jié)果顯示，8-Br-cGMP也阻斷胰島素對Akt的磷酸化效應(yīng)，提示cGMP不僅抑制Akt基礎(chǔ)活性，也抑制配體誘發(fā)的Akt活化。因為Akt的過度激活可導(dǎo)致心肌肥大和心力衰竭，本實驗結(jié)果可能提示，cGMP可防止心衰的發(fā)生。本實驗中還發(fā)現(xiàn)cGMP對Akt

12、磷酸化的抑制作用不能被PKG的抑制劑KT5823所逆轉(zhuǎn)，并且PKG的RNA敲除亦不能影響cGMP對Akt磷酸化的抑制效應(yīng)，說明雖然PKG作為cGMP的重要下游信號，通過使GSK-3β失活而阻止mPTP的開放，但并不參與cGMP對Akt的負性調(diào)節(jié)作用。
　　Thr308和Ser473位點的磷酸化使Akt活化，而絲/蘇氨酸蛋白激酶磷酸酶使這些殘基去磷酸化而導(dǎo)致Akt的失活。因此，我們探討了cGMP是否通過激活絲/蘇氨酸蛋白激酶磷酸酶而

13、使 Akt失活。結(jié)果顯示，絲/蘇氨酸蛋白激酶磷酸酶抑制劑Calyculin A（5nmol/L）使Akt Ser473位點磷酸化明顯增加，且此效應(yīng)被8-Br-cGMP所阻斷，提示cGMP能活化絲/蘇氨酸蛋白激酶磷酸酶，從而導(dǎo)致Akt失活。為了進一步證實這一發(fā)現(xiàn)，我們利用比色法進一步檢測了蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase2A，PP2A）的活性。結(jié)果顯示，8-Br-cGMP使PP2A活性明顯增加。這些結(jié)果均表明，cGM

14、P通過激活蛋白激酶磷酸酶尤其是PP2A而抑制Akt的活性。
　　小結(jié)：
　　1. cGMP通過PKG抑制GSK-3β的活性并阻止mPTP的開放，從而保護心臟；
　　2. cGMP對Akt活性起負性調(diào)節(jié)作用；
　　3. cGMP抑制Akt的活性主要通過激活PP2A，而不是通過PKG信號通路；
　　4. cGMP對心肌的生存具有雙重調(diào)節(jié)作用。
　　第二部分:自噬在心肌缺血再灌注損傷中的作用及其機制研究

15、r>　　缺血性心臟?。╥schemic heart disease，IHD）是嚴重威脅人類健康的最常見疾病之一。IHD的基本病理生理過程是心肌缺血，在其治療過程中再灌注會引發(fā)缺血區(qū)功能障礙加重和結(jié)構(gòu)損傷，稱為再灌注損傷（reperfusion injury）。有效防治再灌注損傷已成為醫(yī)學(xué)界亟待解決的重要課題。再灌注損傷的發(fā)生機制十分復(fù)雜，且尚未完全闡明。普遍認為，自由基、鈣超載、心肌能量代謝障礙、炎性反應(yīng)與細胞凋亡等在再灌注損傷中起重要

16、作用。自噬（Autophagy）作用是廣泛存在于大部分真核細胞中的一種生命現(xiàn)象，是溶酶體對自身結(jié)構(gòu)的吞噬降解，它是細胞內(nèi)的再循環(huán)系統(tǒng)。細胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下有自噬活動，同時各種應(yīng)激如饑餓和低氧癥也可以誘發(fā)自噬。自噬是一種細胞生存機制，但在某些條件下也導(dǎo)致細胞死亡（自噬性死亡或Ⅱ型程序性死亡）。最近的研究表明，心肌缺血/再灌注時可誘發(fā)自噬，但其發(fā)生的時期和具體作用尚不清楚。弄清缺血/再灌注過程中自噬啟動時期及強度的演變，對再灌注損傷的防治可能起

17、重要的指導(dǎo)作用。自噬的調(diào)控主要是由Ⅰ型和Ⅲ型磷酸肌醇三磷酸激酶（PI3K）來完成，其中Ⅰ型PI3K通過激活雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）來抑制自噬的發(fā)生，即負性調(diào)節(jié)機制；自噬的另一種調(diào)節(jié)方式為mTOR非依賴性調(diào)節(jié)機制，也稱為正性調(diào)節(jié)機制，是Ⅲ型PI3K通過增加Beclin l蛋白的表達而誘發(fā)。LC3是Atg8在哺乳動物中的同源物，已被明確參與自噬過程。LC3有LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ

18、兩種亞型，其中LC3-Ⅰ是胞漿蛋白，LC3-Ⅱ定位于前自噬體和自噬體，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值是自噬體形成數(shù)量的重要標(biāo)志。了解心肌缺血/再灌注時自噬發(fā)生的調(diào)控機制，有助于認識再灌注損傷的發(fā)病機制，并有助于尋找治療再灌注損傷的有效方法?；谝陨侠碚摚狙芯砍醪教接懥诵募∪毖?再灌注時自噬的發(fā)生時期、自噬在再灌注損傷中的具體作用以及其調(diào)控機制。
　　本實驗首先用Langendorff裝置制備大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷模型，在缺血0

19、、10、20和30 min時和再灌注10、30、60和120 min時采集心臟組織標(biāo)本，用Western blotting方法檢測LC3蛋白的表達。結(jié)果顯示，在缺血期LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值雖有增加趨勢，但與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，自噬活動并沒有加強。而在再灌注期不同時間點自噬活動均顯著加強，說明自噬在心肌再灌注損傷中起一定作用。
　　為了進一步探討自噬在再灌注損傷中的確切作用，本研究觀察了3-甲基腺嘌呤（3-methyla

20、denine，3-MA）和腺苷受體激動劑（N-Ethylcarboxamidoadenosine，NECA）對自噬和心肌梗死的影響。3-MA為特異性自噬抑制劑，而NECA則為腺苷A2受體擬似劑，是公認的心臟保護物質(zhì)。再灌注5 min之前開始用3-MA和NECA進行干預(yù)并持續(xù)35 min。于再灌注10、30、60和120 min時采集心臟組織標(biāo)本，用Western blotting檢測LC3蛋白的表達，以觀察3-MA和NECA對自噬的影響

21、。再灌注120 min結(jié)束后，TTC染色法測定心肌梗死面積以觀察兩種干預(yù)藥物對心肌梗死面積大小的影響，推測自噬在再灌注損傷中的具體作用。結(jié)果顯示，3-MA抑制再灌注損傷誘發(fā)的自噬，并減少心肌梗死面積，說明自噬在心肌再灌注損傷中起有害作用。NECA既能抑制自噬，同時也減輕再灌注引起的心肌梗死。這說明NECA抑制自噬活動可能是其保護再灌注心臟的機制之一。
　　為了探討再灌注誘發(fā)自噬的機制，本研究用Western blotting方法分

22、別檢測了缺血期和再灌注期Beclin1和mTOR的活性。結(jié)果顯示，在缺血期和再灌注期，Beclin1蛋白的表達均沒有增加，反而出現(xiàn)了下降的趨勢。Beclin1是自噬正性調(diào)節(jié)機制中的關(guān)鍵基因，說明在大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷模型中，自噬的發(fā)生并不主要依賴于其正性調(diào)節(jié)機制。進一步實驗顯示，mTOR的活性在缺血期和再灌注期均降低，說明負性調(diào)節(jié)機制的減弱可能是誘發(fā)自噬的原因。
　　小結(jié)：
　　1.在大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷模型