自噬在神經(jīng)突起退化過(guò)程中的作用及自噬溶酶體在突起內(nèi)的動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、神經(jīng)元軸突和樹(shù)突（或統(tǒng)稱為“突起”）的退化是一個(gè)自我消亡的過(guò)程，其死亡方式有別于神經(jīng)元胞體的凋亡，并在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。在眾多神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中，突起退化現(xiàn)象頻繁出現(xiàn)，且時(shí)常早于神經(jīng)元胞體死亡，甚至?xí)l(fā)胞體死亡，導(dǎo)致患者的行為功能障礙。盡管如此，人們對(duì)于突起退化調(diào)控機(jī)制尚知之甚少。
　　 自噬是細(xì)胞的代謝方式之一，在饑餓條件下，細(xì)胞通過(guò)蛋白降解，使細(xì)胞質(zhì)中物質(zhì)和細(xì)胞器得以循環(huán)利用。研究結(jié)果表明，自噬與神經(jīng)

2、退行性疾病有關(guān)，而自噬在這些疾病中起著促進(jìn)細(xì)胞死亡還是維持細(xì)胞存活的作用，尚存在著爭(zhēng)議。而自噬是如何調(diào)控神經(jīng)突起退化的也還不清楚。
　　 本課題通過(guò)運(yùn)用小鼠頸上神經(jīng)節(jié)(superior cervical ganglion，SCG)神經(jīng)元，研究自噬在不同方式誘導(dǎo)的神經(jīng)突起退化過(guò)程中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在體外瓦勒氏交性、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)剝奪以及微管干擾引發(fā)的交感神經(jīng)元突起退化過(guò)程中，均伴隨

3、著自噬的誘發(fā)。突起退化時(shí)，自噬體/自噬溶酶體和瓦解的骨架蛋白—起堆積在突起串珠中。自噬誘發(fā)標(biāo)志之一的微管相關(guān)蛋白輕鏈Ⅱ(microtubule-associated protein light chain3.Ⅱ，LC3-Ⅱ)的表達(dá)水平在突起退化早期顯著上調(diào)。而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)可以有效阻止突起活性的喪失，維持線粒體功能，并抑制突起退化現(xiàn)象。此外，通過(guò)RNA干擾下調(diào)自噬關(guān)鍵基因atg7和b

4、eclinl的表達(dá)水平顯著緩解了NGF剝奪導(dǎo)致的突起退化；低表達(dá)Atg7還可以抑制體外瓦勒氏變性誘發(fā)的突起退化。
　　 此外，在血清剝奪后的PC12細(xì)胞突起中，我們也同樣觀察到了自噬溶酶體的蓄積。利用熒光漂泊恢復(fù)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)mRFP-LC3標(biāo)記的自噬溶酶體在活細(xì)胞中是運(yùn)動(dòng)的結(jié)構(gòu)。PC12細(xì)胞的實(shí)時(shí)熒光成像實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了自噬溶酶體在細(xì)胞內(nèi)沿著突起作順向和逆向運(yùn)輸，它們?cè)谶\(yùn)動(dòng)過(guò)程中時(shí)常停頓，有時(shí)還會(huì)改變方向。通過(guò)計(jì)算機(jī)圖像處理，對(duì)自

5、噬溶酶體運(yùn)動(dòng)的特征參數(shù)進(jìn)行了定量分析，研究發(fā)現(xiàn)自噬溶酶體運(yùn)動(dòng)的平均速度與其囊泡大小相關(guān)，直徑大的自噬溶酶體運(yùn)動(dòng)相對(duì)緩慢；直徑較小的自噬溶酶體沿突起快速運(yùn)動(dòng)，2min內(nèi)運(yùn)動(dòng)位移在5μm以上的囊泡順、逆向運(yùn)動(dòng)的平均速度分別約為0.33μm/s和0.39μm/s，而最快運(yùn)動(dòng)速度則分別可達(dá)1.22μm/s和1.51μm/s，2min內(nèi)可跟蹤到的長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)運(yùn)的囊泡連續(xù)運(yùn)動(dòng)50μm以上。微管干擾劑破壞微管結(jié)構(gòu)后，自噬溶酶體停止運(yùn)動(dòng)，提示自噬溶酶體的運(yùn)

6、輸依賴于微管。而添加分子馬達(dá)蛋白kinesin或dynein的阻斷劑也同樣影響著自噬溶酶體在突起內(nèi)的順、逆向運(yùn)輸。
　　 綜上所述，本課題的研究取得了以下創(chuàng)新性成果：①揭示了神經(jīng)突起退化過(guò)程伴隨著自噬的誘發(fā)，自噬活性在突起病變?cè)缙陲@著上升；②添加自噬抑制劑或下調(diào)自噬相關(guān)基因atg7或beclinl的表達(dá)，可有效延緩?fù)黄鹜嘶?；③通過(guò)活細(xì)胞熒光成像技術(shù)，發(fā)現(xiàn)并記錄了自噬溶酶體在PC12細(xì)胞突起內(nèi)進(jìn)行順逆向快速運(yùn)輸?shù)膭?dòng)態(tài)過(guò)程，運(yùn)用計(jì)算

7、機(jī)圖像處理手段定量系統(tǒng)的分析了運(yùn)動(dòng)的特征參數(shù)；④運(yùn)用熒光雙標(biāo)記技術(shù)，直觀的顯示自噬溶酶體沿微管進(jìn)行運(yùn)動(dòng)。分子馬達(dá)kinesin和dynein分別介導(dǎo)著自噬溶酶體的順、逆向運(yùn)輸。本課題結(jié)合細(xì)胞分子生物學(xué)、活細(xì)胞熒光成像技術(shù)以及計(jì)算機(jī)圖像處理手段，系統(tǒng)闡述自噬在神經(jīng)突起退化過(guò)程中的作用，并全面分析了自噬溶酶體在突起內(nèi)的動(dòng)力學(xué)特征，在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。研究結(jié)果提示自噬對(duì)神經(jīng)元突起退化起著重要的調(diào)控作用，為更好地理解軸突和樹(shù)突死亡機(jī)制提供線索，